麻痹性貝毒的研究進(jìn)展

麻痹性貝毒的研究進(jìn)展

pvc毒素的檢測(cè)近年來(lái)，世界上有害浪潮的頻發(fā)、程度和影響呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，并給人類(lèi)健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖和生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)了嚴(yán)重的破壞。赤潮的主要危害之一是某些赤潮藻類(lèi)能夠產(chǎn)生毒素,毒素通過(guò)食物鏈進(jìn)入貝體內(nèi),人們食用染有貝毒的貝類(lèi)后造成中毒甚至死亡。赤潮毒素的毒性各異,根據(jù)毒素對(duì)人類(lèi)引發(fā)的中毒癥狀和藻源,可分為麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)、腹瀉性貝毒(diarrheticshellfishpoisoning,DSP)、神經(jīng)性貝毒(neurotoxicshellfishpoisoning,NSP)、記憶缺失性貝毒(amnesiashellfishpoisoning,ASP)和西加魚(yú)毒(ciguatera)等,其中以PSP分布最廣,危害最大。我國(guó)4大海域均有檢出。PSP毒素是一類(lèi)神經(jīng)肌肉麻醉劑,與興奮膜上的電壓門(mén)控Na+通道位點(diǎn)的氨基酸殘基高度親和,通過(guò)選擇性阻斷Na+內(nèi)流,抑制動(dòng)作電位的形成,造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙。PSP對(duì)酸、熱穩(wěn)定,一般的食品加工很難破壞其毒性,中毒后死亡率非常高,其中石房蛤毒素毒性是眼鏡蛇毒素的80倍。更嚴(yán)重的是,這類(lèi)毒素目前尚無(wú)對(duì)癥的解毒劑。因此,國(guó)內(nèi)外對(duì)PSP的檢測(cè),特別是PSP毒素的快速篩查技術(shù)尤為重視。目前國(guó)際上有關(guān)PSP的調(diào)查、檢測(cè)多采用小鼠法和HPLC。小鼠法雖然快捷,能給出樣品的毒性,但需大量的小鼠,花費(fèi)大、耗時(shí)、靈敏度低、假陽(yáng)性高、受待檢樣品量和標(biāo)準(zhǔn)活體動(dòng)物的限制,用于批量樣品的檢測(cè)尚不夠理想。HPLC對(duì)樣品預(yù)處理?xiàng)l件要求很高,費(fèi)用昂貴,且標(biāo)準(zhǔn)品問(wèn)題難以有效解決,更重要的不能及時(shí)有效、準(zhǔn)確地反映樣品的實(shí)際毒性,因而也不理想。利用電壓敏感染料(Voltagesensitivedye)光學(xué)記錄膜電位是電生理研究中的一項(xiàng)嶄新技術(shù),具有非介入性,高度時(shí)間、空間分辨力的特點(diǎn)。應(yīng)用電壓敏感染料對(duì)記錄細(xì)胞或組織進(jìn)行一定的染色,當(dāng)膜電位變化時(shí),作為分子轉(zhuǎn)換器,電壓敏感染料隨膜電位的變化在膜表面出現(xiàn)熒光或吸光變化,這些光學(xué)變化被探測(cè)系統(tǒng)記錄,從而獲得膜電位變化的信息。Bis-oxonol是一種慢反應(yīng)電壓敏感染料,潘雅萍等利用Bis-oxonol建立了一種適用于高通量的鉀通道調(diào)節(jié)劑快速篩選方法。Russell等根據(jù)PSP毒素能夠抑制藜蘆定誘導(dǎo)神經(jīng)突觸體去極化作用的原理,利用對(duì)電壓敏感的熒光玫瑰精探針檢測(cè)神經(jīng)突觸體膜電壓的變化用于PSP的檢測(cè)。由于該方法直接利用了毒素的毒理特征,能真正反映樣品的實(shí)際毒性,且靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、方便,對(duì)儀器的要求不高,因此是一種頗有潛力的貝毒篩選方法。但由于小鼠突觸體的制備比較復(fù)雜,影響和限制了其推廣和應(yīng)用。為克服這一缺點(diǎn),本文擬選擇易培養(yǎng)且鈉通道豐富的膀胱癌移行細(xì)胞T24,采用Bis-oxonol建立一種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的、基于毒素毒理特征的、用于PSP毒素檢測(cè)的電壓敏感熒光染料測(cè)定法。1實(shí)驗(yàn)部分1.1ympus分布CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Themro),F-4500熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi),超凈工作臺(tái)(蘇州),倒置顯微鏡(日本Olympus),電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(南京),低速離心機(jī)(Dopont),電子天平,血球計(jì)數(shù)板。胎牛血清(杭州四季青公司),DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(杭州吉諾公司),胰蛋白酶(上海生工),熒光染料Bis-oxonol,藜蘆定(Veratridine)和短桿菌肽(Gramicidin)(Sigma公司),GTX2,3由暨南大學(xué)理工學(xué)院江天久研究員提供,其他試劑為分析純。1.2樣品采集和處理膀胱癌移行細(xì)胞系T24購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;昆明系雄性小鼠,體重16～20g,由暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供;貝類(lèi)購(gòu)自廣州市黃沙海產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng),共5種,分別為海灣扇貝(Argopectenirradians)、華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)、翡翠貽貝(Pernaviridis)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)、西施舌(Coelomactraantiquata)。樣品采集后,迅速送至實(shí)驗(yàn)室,洗凈外殼泥沙,將肉與殼分離。對(duì)于海灣扇貝和華貴櫛孔扇貝,將其消化腺剪下單獨(dú)保存,將處理的樣品立即放入-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?.3dmem/fps2細(xì)胞培養(yǎng)將T24細(xì)胞接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2d換一次液,待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化傳代。1.4moll-1的誘導(dǎo)酶熒光測(cè)定參照Louzao的方法。取適量細(xì)胞密度為2.5×105cells·mL-1的細(xì)胞懸液加入至1mL的比色杯中,依次加入終濃度為4nmol·L-1的Bis-oxonol、40μmol·L-1的藜蘆定和一定濃度的GTX2,3毒素標(biāo)準(zhǔn)品,使毒素的終濃度分別為2,20,40,80和100ng·mL-1,最后加入10μg·mL-1短桿菌肽。對(duì)照組加入雙蒸水。于激發(fā)波長(zhǎng)530nm,發(fā)射波長(zhǎng)560nm,狹縫5.0nm,流速1200nm·min-1條件下測(cè)定熒光,計(jì)算GTX2,3對(duì)熒光強(qiáng)度的抑制率,繪制抑制率與毒素濃度間的關(guān)系曲線。1.5sdp的制備取適量貝肉,瀝凈多余水分,勻漿。取100g于燒杯中,加入100mL0.18mol·L-1鹽酸溶液,攪拌均勻,調(diào)節(jié)pH2.0～4.0,徐徐煮沸5min,充分?jǐn)嚢琛＠鋮s至室溫,再次調(diào)節(jié)pH2.0～4.0,于4000r·min-1離心5min,取上清液,即得PSP粗提掖。采用上述熒光染料測(cè)定法和小鼠生物測(cè)定法測(cè)定毒素含量。小鼠生物測(cè)定采用AOAC(associationofofficialanalyticalchemists)推薦的“麻痹性貝毒小鼠測(cè)定法”進(jìn)行,結(jié)果以鼠單位(MU·g-1)表示,1個(gè)小鼠單位是指使1只體重20g小鼠在5min內(nèi)死亡的毒素的量,相當(dāng)于0.18μgSTX。2結(jié)果與分析2.1降低精準(zhǔn)裝樣中bis-o體等的熒光強(qiáng)度于細(xì)胞懸液中加入Bis-oxonol、藜蘆定和一定濃度的GTX2,3后,細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化曲線如圖1所示。可以看出,加入Bis-oxonol后細(xì)胞熒光強(qiáng)度趨于不變;加入藜蘆定誘導(dǎo)細(xì)胞去極化后,熒光強(qiáng)度迅速增加;加入GTX后,熒光強(qiáng)度明顯降低;加入短桿菌肽使細(xì)胞完全去極化,熒光強(qiáng)度再次升高。表明毒素GTX的加入可有效改變細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。由于Bis-oxonol在細(xì)胞內(nèi)外的分散具有電壓依賴(lài)性,達(dá)到能斯特平衡后,加入藜蘆定誘導(dǎo)細(xì)胞去極化。鈉通道開(kāi)放,Na+內(nèi)流,陰離子染料Bis-oxonol被釋放到細(xì)胞膜表面,膜表面染料濃度增加,熒光增強(qiáng)。加入鈉通道的阻斷劑GTX2,3,降低藜蘆定誘導(dǎo)的去極化,Bis-oxonol又進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞膜表面染料濃度降低,熒光強(qiáng)度也會(huì)降低。最后加入短桿菌肽使細(xì)胞完全去極化,熒光強(qiáng)度再次升高。2.2劑量-效應(yīng)曲線圖2為熒光強(qiáng)度與GTX2,3濃度的關(guān)系?？梢钥闯?加入不同濃度GTX時(shí),細(xì)胞熒光強(qiáng)度發(fā)生不同程度的降低,熒光強(qiáng)度的變化與GTX之間存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。進(jìn)一步計(jì)算GTX2,3對(duì)熒光強(qiáng)度的抑制率,繪制抑制率與毒素濃度間的關(guān)系曲線,如圖3?？梢钥闯?毒素濃度在2～100ng·mL-1之間時(shí),抑制率與GTX的濃度呈明顯的的線性關(guān)系,R2達(dá)0.98,說(shuō)明可以利用PSP毒素對(duì)藜蘆定誘導(dǎo)細(xì)胞去極化的抑制作用來(lái)測(cè)定毒素的含量。2.3stx毒力較高市售貝類(lèi)PSP毒素的檢測(cè)結(jié)果如表1所示。由于不同的毒素毒力有顯著不同,為便于比較,表1中將小鼠法和熒光法測(cè)定結(jié)果均換算成STX毒力,1MU相當(dāng)于0.18～0.22μgSTX,1μgGTX2,3相當(dāng)于0.76μgSTX?？梢钥闯?兩種方法的檢測(cè)結(jié)果基本一致,熒光檢測(cè)法比小鼠檢測(cè)法檢出限更低,靈敏度更高,小鼠法的檢出限只有160ngSTX·mL-1,相當(dāng)于210ngGTX·mL-1,而熒光檢測(cè)法的最低檢測(cè)限為2ng·mL-1。3sd-4-ccs-o地位法檢測(cè)麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoison,PSP)是目前世界上分布最廣、危害最嚴(yán)重的一類(lèi)貝毒,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種衍生物,按其取代基不同可分為四種類(lèi)型:(1)氨基甲酸酯類(lèi)毒素(Carbamatetoxins),包括石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)、新石房蛤毒素(NeoSTX)和膝溝藻毒素1-4(Gonyautoxins,GTX1-GTX4)等;(2)N-磺酰氨甲?；?lèi)毒素(N-sulfocarbamoyltoxins),包括B1-B2和C1-C4等;(3)脫氨甲酰基類(lèi)毒素(Decarbamoyltoxins),包括dcSTX、dcneoSTX和dcGTX1-4等;(4)脫氧脫氨甲酰基類(lèi)毒素(Deoxydecarbamoyltoxins),包括doSTX和doGTX2-3。不同毒素的毒力大小不同,毒力大小依次為:STX>dcSTX=neoSTX>GTX1,4>dcneoSTX>GTX2,3>dcGTX2,3>GTX5。由于PSP毒素屬于劇毒品,可作為化學(xué)武器,國(guó)際上限制流通,因此標(biāo)準(zhǔn)品的獲得非常困難。另外,新的PSP毒素衍生物的不斷發(fā)現(xiàn)提示以HPLC為代表的成分分析法會(huì)存在毒素漏檢的情況,因此很難準(zhǔn)確反映樣品的實(shí)際毒性。其他方法如MS-LC、毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的液相色譜技術(shù)有了一定的改進(jìn),但這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備,樣品前處理復(fù)雜,也存在類(lèi)似HPLC的問(wèn)題。免疫檢測(cè)法方便、迅速,但價(jià)格高,偶聯(lián)難度大且存在交叉反應(yīng),不能完全體現(xiàn)出樣品的毒性。本文以膀胱癌移行細(xì)胞T24為材料,采用熒光探針Bis-oxonol,借助PSP毒素阻塞鈉通道的特性,建立了一種以毒素毒理特征為基礎(chǔ)的PSP毒素?zé)晒鉁y(cè)定法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,毒素濃度在2～100ng·mL-1之間時(shí),熒光強(qiáng)度的抑制率與GTX的濃度呈明顯的線性關(guān)系,表明利用PSP毒素對(duì)藜蘆定誘導(dǎo)細(xì)胞去極化的抑制作用來(lái)測(cè)定毒素的含量是可行的。為進(jìn)一步說(shuō)明這一問(wèn)題,我們分別用本方法和小鼠生物測(cè)定法測(cè)定了市售貝類(lèi)中的PSP毒素,并進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,兩種方法檢測(cè)結(jié)果基本相同,與文獻(xiàn)對(duì)相關(guān)貝類(lèi)的檢測(cè)結(jié)果基本一致。與小鼠法相比,熒