塔瑪亞歷山大藻對鰓組織na

塔瑪亞歷山大藻對鰓組織na

0n-磺酰氨甲?；惗舅刂卸镜谋l(fā)嚴重威脅了畜牧業(yè)。麻痹性苦毒（pm）是一個重要因素。在亞太地區(qū)，從1934年到1994年的赤潮對水產(chǎn)養(yǎng)殖的損害中，麻痹性苦毒事件占41.7%。這些事件主要是由p.bamaenevar.cov等甲藻引起的。大多數(shù)時間分布在塔馬利亞海岸。麻痹性貝毒是一類四氫嘌呤的衍生物.現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的毒素有20多種,根據(jù)R4基團的不同可以分為4類,分別是氨基甲酸酯類毒素(Carbamatetoxin),包括石房蛤毒素(STX),新石房蛤毒素(neoSTX),膝溝藻毒素1-4(GTXI-4);N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfcarbamoy1toxins),包括B1-2,C1-4;脫氨甲酰基類毒素(decarbamoyltoxin),包括dcSTX,dcneoSTX,dcGTXI-4;脫氧脫氨甲?；惗舅?deoxydecarbamoy1toxins),包括doSTX,doGTX2,3,最近又在一種蟹Zosimusaeneus中檢出了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的N-羥基衍生物(N-hydroxycarbamoylderivatives)hySTX和hyneoSTX,可能是一類新的麻痹性貝毒毒素.由于Na+,K+—ATP酶在低等、高等生物體內(nèi)普遍存在,具有廣泛的生態(tài)意義,在機體中起到至關重要的作用,并且是多種毒物攻擊的靶點.因此在本次實驗中采用檢測染毒生物體興奮性和分泌性組織中Na+,K+—ATP酶活力的方法,對塔瑪亞歷山大藻對該酶的影響及機理進行研究.傳統(tǒng)的觀點認為毒素對貝類本身沒有影響,貝類只是起中間媒介的作用.但80年代以后的研究表明,有毒藻能夠影響貝類,影響的大小與貝的種類以及以往是否接觸過有毒藻有關.不同種的貝對有毒藻的反應差別很大.從已有的實驗看,赤潮密度下有毒藻可以使貝產(chǎn)生下述反應:1)是閉殼反應,尤其是沒有接觸過有毒藻的貝中閉殼反應明顯;2)濾水率下降,這在一定程度上與貝的閉殼反應有關,但也有貝表現(xiàn)出濾水率增加或不變的現(xiàn)象;3)攝食的選擇性,大部分可以攝食有毒藻,但有的貝如沙海螂(Mya.arenaria)表現(xiàn)出攝食選擇現(xiàn)象,有毒藻只出現(xiàn)在假糞中;4)影響足絲分泌;5)耗氧率和心臟活動受到影響.文獻對塔瑪亞歷山大藻對扇貝受精、胚胎發(fā)育及幼體變態(tài)等影響進行了研究,發(fā)現(xiàn)該藻對受試生物存在明顯的抑制效應.但有關塔瑪亞歷山大藻對動物組織中ATP酶的影響目前在國內(nèi)尚未見報道.為進一步了解塔瑪亞歷山大藻的毒作用機制,筆者選用分布廣,數(shù)量多,有一定經(jīng)濟價值的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、翡翠貽貝(PernaviridisLinnaeus),研究塔瑪亞歷山大藻體對這些動物組織Na+,K+—ATP酶的影響.1材料和方法1.1na+、k+—原理Na+,K+—ATP酶是一組在細胞內(nèi)離子轉(zhuǎn)運和能量代謝過程中起重要作用的酶系統(tǒng).它從水解ATP分子中獲得能量,逆電化學梯度轉(zhuǎn)運Na+和K+,也稱鈉泵.Na+,K+—ATP酶廣泛分布于各類細胞質(zhì)膜上,其活性在不同的組織內(nèi)差異很大,在興奮性和分泌性組織中酶活性很高.麻痹性貝毒的毒理機制是在分子層級上,阻斷鈉離子內(nèi)流,其對鈉離子通道具有特殊親和性.當毒素與鈉離子通道結合后,將會使神經(jīng)傳導發(fā)生困難.使細胞不能提供正常活動所需要的能量,嚴重情況下,可導致生物死亡.Na+,K+—ATP酶將腺三磷(ATP)水解為腺二磷(ADP)和無機磷,在實驗中以無機磷的釋放量來表示酶的活性.1.2非規(guī)劃性培養(yǎng)基塔瑪亞歷山大藻由本實驗室培養(yǎng),培養(yǎng)條件為非無菌培養(yǎng),f/2培養(yǎng)基;溫度(20±0.5)℃;光照3000lx;光暗比為12∶12.實驗用藻取自指數(shù)生長期.1.3設備1)DU520型紫外分光光度計;2)2DPR-52D型高速冷凍離心機;3)玻璃勻漿器;4)電子天平;5)解剖工具.1.4實驗方法1.4.1對不同浮液藻細胞的毒力將采回的菲律賓蛤仔在沙濾海水中暫養(yǎng)24h后,挑選大小均勻、足絲分泌正常的個體隨機分配到3個實驗組中,每組放入8只蛤仔(殼長為(3±0.56)cm)及1000mL沙濾海水.對照組水體僅為1000mL沙濾海水,實驗組分別加入濃縮藻液,使其水中塔瑪亞歷山大藻細胞濃度分別為35000cell/mL和17500cell/mL.在不充氣,不換水下染毒48h后,解剖取樣.暫養(yǎng)后的翡翠貽貝被分在染毒組和對照組,每組放8只,對照組飼養(yǎng)在2000mL沙濾海水中,染毒組為2000mL沙濾海水加入濃縮藻液,使藻細胞密度為10000cell/mL,染毒48h后解剖取樣.1.4.2活性成分檢測由于菲律賓蛤仔個體組織較小,故取樣時,將1組合為1個樣進行測量,而貽貝則1貝為1個樣品.解剖出來的鰓及內(nèi)臟囊先稱重,每克樣品中加入4mL線粒體提取液,勻漿后以2750rad/min離心10min,以去除細胞碎片.上清液以11500rad/min的轉(zhuǎn)速離心20min,得線粒體沉淀,將線粒體沉淀物溶于1mL線粒體懸浮液中,置于-80℃低溫冰箱內(nèi)以供測定Na+,K+—ATP酶活力使用.1.4.3樣品中的蛋白質(zhì)含量測定1.4.4na-，k-kp酶活性測定2結果2.1兩組k+—菲律賓蛤仔的實驗結果結果顯示實驗組比對照組的菲律賓蛤仔鰓及內(nèi)臟囊Na+,K+—ATP酶的活性高,而17500cell/mL組酶活力又比35000cell/mL高.且組間差異顯著(P<0.5).見圖1.2.2兩組血清na+、k+—翡翠貽貝實驗結果由表1可見,染毒組翡翠貽貝鰓組織內(nèi)的Na+,K+—ATP酶平均活力為10.032±2.231,較對照組的6.449±2.272要強,兩組個體間鰓組織Na+,K+—ATP酶活力差異顯著(P<0.5).3藻密度對金魚肝胰腺組織na+,k+—討論水中含有塔瑪亞歷山大藻使得菲律賓蛤仔鰓組織Na+,K+—ATP酶活性有所增高,但并不是隨著藻密度的增大而增大,在實驗中可以看出藻密度在17500cell/mL時酶活力達到較高水平(2.112),在35000cell/mL時有所下降(2.073).而水中該藻密度為10000cell/mL時同樣明顯提高翡翠貽貝鰓組織Na+,K+—ATP酶活性(比對照組增加0.6倍).這說明塔瑪亞歷山大藻活藻體可造成貝類鰓組織Na+,K+—ATP酶活性改變.而且,在較低的濃度下往往是增加酶活性,較高濃度下酶的活性反而下降.筆者認為這是因為PSP進入動物體與鈉離子通道結合,阻斷鈉離子內(nèi)流.而生物的應激反應促使酶超?；顒右缘窒：?因此使得Na+,K+—ATP酶的活力增加.生物體在這種不良環(huán)境下的這種應激反應在不少研究中已被證實,如藻類在低濃度農(nóng)藥影響下會增加光合作用強度和分裂速度,但隨著農(nóng)藥濃度的加大,二者均被抑制而降低.當然應激反應是有限的,如果外界影響超出機體的調(diào)節(jié)能力,則必然導致機體正常功能受損,因此,最終將表現(xiàn)出抑制效應.本實驗也顯示隨著藻類密度的增加,塔瑪亞歷山大藻的毒性使得動物Na+,K+—ATP酶受到抑制,活性轉(zhuǎn)而呈下降趨勢.4排肝胰腺組織p酶活性的變化水中具有一定密度(