免疫磁珠分選cd34

免疫磁珠分選cd34

作為早期干部分和早期細(xì)胞的特征性特征，sd34作為外生殖器和骨髓移植的廣泛使用。CD34+細(xì)胞主要存在于骨髓、外周血和臍血中,但是均含量低,需經(jīng)過分選富集達(dá)到高純度來應(yīng)用。CD34+細(xì)胞分選技術(shù)成為研究造血干細(xì)胞及其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵的制約技術(shù)。所以,CD34+的來源以及如何獲得高活性、高純度的CD34+細(xì)胞成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用臍血作為研究對象,采用免疫磁珠正性分選法探討高純度的CD34+的分選方法和細(xì)胞來源。1材料和方法1.1血液器相關(guān)疾病孕婦年齡20～35歲、足月妊娠、無并發(fā)癥、病毒檢測HbsAg、HCV、anti-HIV1/2抗體、梅毒抗體陰性。孕婦及丈夫均無血液系統(tǒng)疾病及遺傳性疾病家族史。每次采血量80～110mL。標(biāo)本來自于廣州南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院產(chǎn)科,所采臍血均征得產(chǎn)婦同意。1.2免疫細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)和免疫藥物的配制無菌臍帶血采血袋(PCD-A抗凝);流式細(xì)胞儀,SW-CJ-2FD超凈工作臺(江蘇,蘇州),離心機(jī);淋巴細(xì)胞分離液(相對密度1.077)購自AXIS-SHIELD公司,胎牛血清購自Hyclone;流式檢測單克隆抗體CD34-PE,CD34-FITC,CD34同型對照抗體均為自BD公司產(chǎn)品;EasySep(r)正選人CD34試劑盒和D-PBS緩沖液購自StemCells公司。1.3淋巴分離液組先將臍血和PBS緩沖液(含2%的胎牛血清)按1∶1稀釋,再將稀釋后血按2∶1的比例沿管壁緩慢加于淋巴分離液上,靜置,分層,離心,800×g,20min,室溫。1.4棄去上清液法吸取中間白膜層于另一無菌試管中,加入5倍體積PBS緩沖液,混勻,離心,250×g,10min,室溫,棄去上清液。收集下層細(xì)胞沉淀,加5倍體積的PBS緩沖液再次洗滌,250×g,10min,室溫,棄去上清。收集細(xì)胞沉淀,定量液體體積于5mL,采用改良牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)單核細(xì)胞。1.5免疫磁珠法的分類CD34+細(xì)胞1.5.1抗體混合物的制備在一無菌試管內(nèi)將單核細(xì)胞濃度調(diào)整約為2×108/mL,體積為1mL,加入100μL的EasySep(r)CD34抗體混合物,用移液器輕輕上下吹打混勻,室溫靜置孵育15min。用移液器用力上下吹打EasySep(r)納米磁珠5次,混勻磁珠后,加入50μL磁珠于細(xì)胞懸液中,充分吹打混勻,室溫孵育10min。1.5.2磁極標(biāo)記細(xì)胞用D-PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞懸液體積到2.5mL,混勻,將試管放入磁極中,靜置5min,將磁極連試管一起拿起,以連續(xù)緩慢的動(dòng)作傾倒磁極至倒置狀態(tài),倒出上清部分。磁性標(biāo)記的細(xì)胞由于EasySep(r)磁極磁場的吸引,仍然留在試管內(nèi)。保持磁極及試管倒置2～3s,然后使試管口恢復(fù)向上的位置。重復(fù)此過程4～5次。最后一次傾倒后將細(xì)胞懸液體積調(diào)整為300μL,計(jì)數(shù)所選得CD34+細(xì)胞數(shù)。1.6測試1.6.1細(xì)胞蛋白檢測將提取的單核細(xì)胞和分選后細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,用0.4%臺盼藍(lán)和細(xì)胞懸液1∶1混合,計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)。死亡的細(xì)胞可被染成藍(lán)色,活細(xì)胞不著色?；罴?xì)胞百分率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。1.6.2cd32+純度檢測提取的單核細(xì)胞和分選后細(xì)胞分為兩管,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105～1×106個(gè)/mL,分別加入CD34-PE抗體和PE陰性對照抗體,避光孵育25～30min后,加2mLPBS離心洗滌后,上機(jī)檢測CD34+純度。2結(jié)果2.1均密度和cd40+細(xì)胞平均密度本次試驗(yàn)共收集臍血15份,單核細(xì)胞平均密度為(1.96±0.34)×107個(gè)/mL,CD34+細(xì)胞平均密度為(1.28±0.15)×105個(gè)/mL。2.2細(xì)胞活性單核細(xì)胞和免疫磁珠方法分選后細(xì)胞活性均達(dá)97%以上。2.3cd治療cd治療前后cd治療前后cd治療前后cd治療的純度比較免疫磁珠方法分選后流式結(jié)果見圖(1,2)。CD34+細(xì)胞的純度鑒定:免疫磁珠分選前CD34+細(xì)胞的純度為:(1.14±0.71)%;免疫磁珠分選后CD34+細(xì)胞的純度為:(91.55±4.11)%;CD34+細(xì)胞的回收率:(52.45±0.37)%。3不同陽性社會培養(yǎng)細(xì)胞的純度、聯(lián)合用藥與實(shí)驗(yàn)結(jié)果人的造血干細(xì)胞具有多系分化潛能,主要存在于CD34+細(xì)胞群中,CD34+只占骨髓單核細(xì)胞的0.5～1.5%,外周血的0.001～0.01%及臍血的0.5%～3.5%。因此,高效率獲得CD34+細(xì)胞對科研及臨床應(yīng)用具有重要的意義。造血干細(xì)胞的經(jīng)典來源是骨髓,已經(jīng)沿用了40多年,其提供足量的干細(xì)胞用于臨床移植治療已經(jīng)是有目共睹的。供體在注射細(xì)胞因子后,外周血通過分選系統(tǒng)也可以分選出CD34+細(xì)胞。近3年來,大多數(shù)的自體或異體骨髓抑制事實(shí)就是來自外周血而非骨髓的白細(xì)胞。20世紀(jì)80年代末90年代初,多數(shù)學(xué)者開始認(rèn)識到,臍血是造血干細(xì)胞的豐富來源。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)臍血中CD34+細(xì)胞含量平均為(1.14±0.71)%,與骨髓中含量相近。臍血中CD34+細(xì)胞較骨髓和外周血更為原始,增殖能力強(qiáng)、對造血生長因子的刺激反應(yīng)更敏感,且引起移植物抗宿主反應(yīng)低。另外,臍血干細(xì)胞具有來源廣、采集方便等優(yōu)點(diǎn)。因此,臍血在將來的干細(xì)胞研究和臨床應(yīng)用中會發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用的是右旋糖酐包被的磁珠,通過具有雙向特異性的四聚體抗體復(fù)合物(TAC),與靶細(xì)胞特異性結(jié)合,該復(fù)合物同時(shí)識別目的細(xì)胞表面抗原與右旋糖酐。磁性右旋糖酐鐵顆粒很小,可以與TAC標(biāo)記的細(xì)胞有效的結(jié)合,而且不會影響隨后的FACS(流式細(xì)胞分選)分析。這種特異性結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物通過磁場時(shí)會被吸附滯留在磁場中,而非CD34+細(xì)胞不與磁珠結(jié)合,在分選過程就會被傾倒出。在去處磁場后,收集復(fù)合物,從而達(dá)到分選CD34+細(xì)胞的目的。其他不與磁珠結(jié)合的細(xì)胞,如T細(xì)胞會被分選出,從而可以部分的去除T細(xì)胞,可以減輕或減少異體移植GVHD的發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)分選后可以得到高純度(91.55±4.11)%造血干細(xì)胞,高純度的造血干細(xì)胞的獲得對本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究具有重要的意義。而且,高純度的造血干細(xì)胞的獲得對于癌癥的移植治療、自身免疫系統(tǒng)性疾病的自體移植、基因治療和其他癥狀的組織修復(fù)都具有重要的意義。目前,以CD34McAb為基礎(chǔ)的陽性分選CD34+細(xì)胞的方法有多種,常用的FACS、IsolexTM系統(tǒng)、CellPro系統(tǒng)、“Panning”AIS系統(tǒng)以及免疫磁珠分選系統(tǒng)。FACS分選的CD34+細(xì)胞及其亞群細(xì)胞的純度可高達(dá)95%～99%,是目前分選CD34+細(xì)胞純度最高的方