登革病毒包膜蛋白的研究進(jìn)展

登革病毒包膜蛋白的研究進(jìn)展

病毒登格病毒（denv）屬于黃毒科黃色病毒，是急性蚊媒感染和登格熱的病原體。按生物學(xué)和免疫學(xué)特性,登革病毒可分為四種血清型,感染人體后均可引起登革熱(denguefever,DF),甚至致死率很高的登革出血熱(denguehaemorrhagicfever,DHF)以及登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。在全球熱帶及亞熱帶地區(qū),有25億人面臨著被DENV感染的危險(xiǎn)。據(jù)估計(jì),每年約有5000萬~10000萬人感染登革病毒,其中50萬人為嚴(yán)重感染,死亡人數(shù)約1.5萬,并且目前尚無有效的防治措施。登革病毒為單股正鏈RNA病毒,其基因組長(zhǎng)約11kb,共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、M/prM和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中,結(jié)構(gòu)蛋白在病毒成熟、感染靶細(xì)胞、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答等方面均發(fā)揮重要作用。1包膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能1.1e蛋白和diii區(qū)包膜(endelope,E)蛋白是登革病毒體最大的結(jié)構(gòu)蛋白和主要包膜糖蛋白,構(gòu)成病毒顆粒表面的突起。編碼E蛋白的E基因約由1500個(gè)堿基組成,位于基因組5′端,編碼489~495個(gè)氨基酸。E蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為53000Mr,E基因兩側(cè)分別與M基因和NS1基因相鄰。E蛋白含有DomainI、DomainⅡ和DomainⅢ·綜述·等三個(gè)功能域:(1)DI區(qū)由3個(gè)不連續(xù)的片段(E1~51、E132~190和E278~293位氨基酸)組成,是由8個(gè)β桶狀結(jié)構(gòu)彎曲形成兩個(gè)橫跨疏水區(qū)的β折疊,位于E蛋白的中部。(2)DⅡ區(qū)由2個(gè)不連續(xù)的片段(E52~131和E191~277位氨基酸)組成,折疊成指樣結(jié)構(gòu)平鋪在成熟病毒表面,與病毒的促融合活性有關(guān)。(3)DIII區(qū)是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立和完整的區(qū)域(E294~392位氨基酸)。該區(qū)含有依賴多重構(gòu)象的中和表位,是病毒毒力的關(guān)鍵區(qū)域。E蛋白功能域上的化學(xué)鍵能夠有效穩(wěn)定其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。DI含有的二硫鍵(Cys3-30)以及DⅡ區(qū)的4個(gè)二硫鍵能協(xié)助穩(wěn)定E蛋白的氨基端,前者和DⅡ區(qū)的Cysl85-285還對(duì)羧基端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)CD環(huán)(cdloop)有穩(wěn)定作用。此外,在E蛋白的膜外段和膜內(nèi)段之間存在著一個(gè)含有2個(gè)α螺旋的莖桿區(qū),可穩(wěn)定E蛋白的三聚體化和prM-E蛋白二聚體的結(jié)構(gòu)。研究指出,E蛋白序列是登革病毒基因組中可變性最高的區(qū)域。E糖蛋白序列中保守序列占據(jù)比例達(dá)到75.2%,其突變率約為20%。同時(shí)E糖蛋白上發(fā)現(xiàn)有大量保守位點(diǎn),而甘氨酸被認(rèn)為是E蛋白上最為保守的氨基酸。登革3型病毒的E蛋白在氨基酸序列37-66、80-121、183-228和242-279等位置擁有很多的抗原表位,不僅有較高分?jǐn)?shù)的平均抗原指數(shù)(averageantigenindex,AI),也表現(xiàn)出較好的親水性。1.2胞表面的吸附與檢測(cè)E蛋白是影響病毒毒力、引起保護(hù)性免疫反應(yīng)和免疫病理損傷的主要成分。在pH為中性或者微堿性時(shí),成熟病毒體表面的E蛋白呈同源二聚體形式,這種二聚體的構(gòu)象決定了病毒的組織親嗜性,并介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合,進(jìn)而感染宿主細(xì)胞。E蛋白是登革病毒中和抗體結(jié)合的主要靶點(diǎn),負(fù)責(zé)病毒在宿主細(xì)胞表面的吸附和酸性條件下病毒與宿主細(xì)胞膜的融合。其主要作用有:(1)在病毒顆粒裝配過程中,E蛋白與prM蛋白插入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜;在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)協(xié)助下,C蛋白與病毒RNA指導(dǎo)裝配出未成熟病毒顆粒,經(jīng)蛋白糖側(cè)鏈加工后從細(xì)胞內(nèi)分泌運(yùn)輸至胞外。病毒在酸性條件下釋放容易失活,而融合蛋白中的組氨酸在抑制E蛋白和Pr多肽片段的相互作用中起到關(guān)鍵作用,這可能成為一種抗病毒戰(zhàn)略,即通過干擾Pr-E蛋白復(fù)合體的相互作用從而抑制病毒顆粒的裝配。(2)病毒表面特異性吸附蛋白(virusattachmentprotein,VAP)與細(xì)胞上相應(yīng)的病毒受體相互作用后,病毒才能吸附于靶細(xì)胞。在感染過程中,E蛋白充當(dāng)?shù)歉锊《綱AP,即宿主細(xì)胞表面病毒受體的配體,介導(dǎo)病毒特異性地與靶細(xì)胞結(jié)合。Zompi等通過異型登革病毒二次感染小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),交叉反應(yīng)的B細(xì)胞與T細(xì)胞均能對(duì)異型登革病毒二次感染起到保護(hù)作用。但是登革病毒的細(xì)胞親和力與其免疫中和能力無相關(guān)性。1.3蛋白d區(qū)的免疫反應(yīng)E蛋白上含有多個(gè)重要的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表位,既能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,也能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體依賴增強(qiáng)感染效應(yīng)(antibodydependentenhancement,ADE)相關(guān)抗體。針對(duì)E蛋白上DⅠ、DⅡ、DⅢ三個(gè)區(qū)所產(chǎn)生的抗體對(duì)中和病毒感染發(fā)揮很大的作用。E蛋白能夠誘生中和抗體,這主要依賴于E蛋白天然構(gòu)象中不連續(xù)抗原功能區(qū)的存在;誘生的中和抗體能夠結(jié)合E蛋白融合多肽和E蛋白受體結(jié)合區(qū)片段,從而發(fā)揮中和作用,并兼具血清型特異性和交叉反應(yīng)性。在應(yīng)對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)上,E蛋白作為重要的血凝素抗原,能促進(jìn)凝血從而抑制抗體的產(chǎn)生。需要注意的是,E蛋白的免疫原性依賴于其自身結(jié)構(gòu)的完整性,當(dāng)?shù)鞍捉到狻⒆冃曰蛘叨蜴I斷裂、半胱氨酸位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)都會(huì)降低其抗原性。登革病毒E蛋白的抗原性與DⅢ區(qū)有著十分緊密的聯(lián)系。DⅢ區(qū)包含中和表位,并且?guī)缀鯖]有交叉抗體。在登革病毒感染中,相較于其他區(qū)域,DⅢ區(qū)誘發(fā)的抗體對(duì)登革病毒具有更強(qiáng)的中和能力。針對(duì)E蛋白DⅢ區(qū)的抗體能對(duì)特定血清型或者多個(gè)血清型起作用,有效中和病毒感染。而針對(duì)DI、DII或prM蛋白產(chǎn)生的抗體對(duì)登革病毒四種血清型顯示出廣泛的交叉活性,但是中和能力明顯較差。研究還發(fā)現(xiàn),免疫血清的中和活性與抗DⅢ的抗體在血清抗體中所占比例呈正相關(guān)。但是,Wahala等指出在自然感染后,人類針對(duì)DⅢ的抗體水平較低,免疫系統(tǒng)對(duì)DⅠ、DⅡ的識(shí)別反應(yīng)能力有可能優(yōu)于對(duì)DⅢ的反應(yīng)。而適當(dāng)?shù)淖魟┖椭亟M蛋白的結(jié)構(gòu),也許可以定向刺激DⅢ相關(guān)抗原表位,來完成一個(gè)有效的免疫反應(yīng)。除此以外,Midgley等從病毒載量與登革出血熱的聯(lián)系中發(fā)現(xiàn),原始抗原痕跡可以很快動(dòng)員免疫記憶從而加快免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。在二次感染的早期,動(dòng)員起來的低水平抗體反應(yīng)可能引發(fā)登革病毒的放大化復(fù)制。在登革病毒所致疾病中,原始抗原痕跡的作用與疫苗接種策略有關(guān):初次給予疫苗時(shí),只要機(jī)體成功建立起針對(duì)登革病毒的免疫反應(yīng),那么這種免疫反應(yīng)對(duì)登革病毒四種血清型的感染均有效果。2在登革病毒中合成多肽衣殼(capsid,C)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為12000Mr,是登革病毒翻譯過程中首先合成的多肽,為登革病毒核衣殼的基本構(gòu)成成分,存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。2.1登革病毒c蛋白的結(jié)構(gòu)在病毒自身復(fù)制與蛋白質(zhì)的翻譯上,Clyde等發(fā)現(xiàn),登革病毒蛋白質(zhì)的翻譯可以從C蛋白讀碼框內(nèi)的不同AUG位置起始,這使得C蛋白能以多種形式存在于宿主細(xì)胞內(nèi);而且還發(fā)現(xiàn)C蛋白讀碼框中的第一和第二個(gè)AUG的存在是病毒有效復(fù)制的必需條件。登革病毒屬于黃病毒屬,而不同黃病毒的C蛋白在氨基酸序列上同源性很低,但是在結(jié)構(gòu)上是保守的。利用核磁共振(NMR)對(duì)登革病毒C蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),登革病毒C蛋白的4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)(α1-α4)分別位于C蛋白26-35、45-58、63-69、74-96位氨基酸殘基上。α1、α2和α3螺旋一起形成了一種三螺旋核心結(jié)構(gòu),其中α2與α3的軸線近乎反向平行,并與α1的軸線成45°角。α4螺旋則從三螺旋核心向外延伸。由于V26、L29、F47、V51、I65、R68以及W69的側(cè)鏈均被包裹在核心的內(nèi)部,三螺旋的內(nèi)部核心具有很強(qiáng)的疏水性。此外,登革病毒C蛋白在溶液中以二聚體形式存在,該二聚體的兩個(gè)單體上的α4螺旋反向平行排列,主要依靠疏水性側(cè)鏈間的相互作用來穩(wěn)定這一構(gòu)象。C蛋白α1螺旋結(jié)構(gòu)(Cα1HP)的存在能夠促進(jìn)病毒RNA的復(fù)制,Cα1HP保守的左側(cè)環(huán)與此功能相關(guān),其頂部的莖環(huán)結(jié)構(gòu)與保證病毒RNA復(fù)制的準(zhǔn)確性有關(guān)。C蛋白的α1螺旋本身并不影響病毒RNA復(fù)制,而它對(duì)病毒復(fù)制的作用主要依賴于其二級(jí)結(jié)構(gòu)本身。2.2prm信號(hào)肽序分子身份證及其在細(xì)胞復(fù)制和復(fù)制中的作用C蛋白主要參與病毒組裝和RNA的包裝,多拷貝的C蛋白將病毒RNA包裹形成核衣殼結(jié)構(gòu)。在病毒顆粒裝配過程中,E蛋白與prM蛋白先插入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,而C蛋白與病毒RNA在胞質(zhì)中裝配成核衣殼,并集中于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞質(zhì)側(cè)。在核衣殼獲得包膜后組裝成未成熟病毒顆粒,再進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至反式高爾基體,并對(duì)E蛋白及蛋白的糖側(cè)鏈進(jìn)行加工,通過細(xì)胞分泌運(yùn)輸至胞外。未成熟的C蛋白羧基端帶有prM蛋白的信號(hào)肽序列,該序列使C蛋白錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,又稱錨定C蛋白。病毒蛋白酶對(duì)信號(hào)肽序列N末端的切割使C蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨问?并游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。有效的黃病毒裝配需要C蛋白可分裂的跨膜錨點(diǎn)和C-prM接點(diǎn)的分裂規(guī)律,并能在prM信號(hào)肽調(diào)控下按一定順序規(guī)律進(jìn)行。Schrauf等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃病毒蛋白C的擴(kuò)展差異能影響早期RNA的合成及其在哺乳動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物宿主細(xì)胞的生長(zhǎng),這為C蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制研究提供了思路。登革病毒C蛋白對(duì)病毒RNA復(fù)制及蛋白翻譯具有調(diào)節(jié)作用,并且C蛋白對(duì)病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)與其核定位現(xiàn)象有關(guān)。C蛋白包括三個(gè)核定位信號(hào),分別為6KKAR9、73KKSK76和雙信號(hào)85RKeigrmlnilnRRRR100。在有關(guān)C蛋白核定位與細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)表明,C蛋白的核定位是與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(deathdomain-associatedprotein,DAXX)相互作用和細(xì)胞凋亡所必需的條件。這種相互作用能夠限制那些集中在細(xì)胞核上的蛋白質(zhì)不在細(xì)胞質(zhì)形成期間出現(xiàn)。C蛋白與DAXX蛋白間存在共定位,穩(wěn)定的HepG2細(xì)胞可以表達(dá)登革病毒C蛋白。在核定位信號(hào)沒有出現(xiàn)的情況下,C蛋白不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核,也不會(huì)與DAXX蛋白相互作用,這就無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3病毒顆粒的構(gòu)建前體膜結(jié)合蛋白(precursor-membrane,prM)和E蛋白都是構(gòu)成病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中組裝成非感染性的未成熟病毒顆粒。prM可裂解產(chǎn)生膜結(jié)合蛋白(membrane,M)。3.1prm和fpsd-pcr檢測(cè)宿主細(xì)胞中hd區(qū)和d區(qū)的耦合M蛋白相對(duì)分子量約為8000Mr,由75個(gè)氨基酸組成,不含有N-糖苷鍵結(jié)合位點(diǎn)。prM為M蛋白的前體蛋白,分子量約為22000Mr。prM由166個(gè)氨基酸組成,以1:1的比例與E蛋白的DⅡ區(qū)相聯(lián)系,被認(rèn)為是E蛋白折疊伴侶,可以防止宿主細(xì)胞內(nèi)病毒的過早融合。prM包含弗林蛋白酶(furin酶)切位點(diǎn),裂解后生成含有與病毒顆粒相關(guān)聯(lián)的跨膜區(qū)的C-末端M段和一個(gè)包含99個(gè)氨基酸的N-末端前體片段。在宿主細(xì)胞furin酶的作用下,prM可被切割為pr片段和M蛋白,并使病毒顆粒表面的E蛋白重排,產(chǎn)生含M蛋白的病毒顆粒。此外,兩個(gè)相鄰的prM的C-末端有助于prM的膜錨定以及E蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸。3.2prm抗體在登革病毒中的作用在未成熟的病毒顆粒中,prM蛋白與E蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面形成二聚體,共同組成病毒表面結(jié)構(gòu)。這種由prM與E蛋白形成的異質(zhì)二聚體,能與病毒RNA/C共同裝配,形成子代病毒顆粒。隨后,子代病毒顆粒釋放,prM被高爾基體上的蛋白酶裂解成M蛋白,而裂解出的可溶部分隨著病毒顆粒的釋放被排到細(xì)胞外。因此,prM的裂解是登革病毒病毒顆粒成熟的標(biāo)志。一般情況下,prM抗體無法完全中和感染,中和作用發(fā)生的飽和程度多穩(wěn)定在10%~60%之間。在四型登革病毒血清型中,多數(shù)中和反應(yīng)有交叉活性。而唯一的例外就是人-抗prM的單克隆抗體5F9和135.3,兩者均在高抗體濃度下顯示近乎100%的中和活性。研究發(fā)現(xiàn),prM誘發(fā)的抗體在登革病毒的各個(gè)血清型中均有很強(qiáng)的交叉反應(yīng),但即使在高濃度下也無法中和感染,甚至促進(jìn)了ADE的發(fā)生。prM在病毒表面的不完全分裂減少了有效病毒中和抗體的密度,使得登革病毒更容易通過prM抗體作用產(chǎn)生ADE。登革病毒prM的不完全裂解以及血清型之間大量的交叉反應(yīng)使得prM抗體反應(yīng)尤為容易放大。促進(jìn)針對(duì)prM的抗體反應(yīng),可以作為免疫逃避,甚至作為病毒的免疫增強(qiáng)戰(zhàn)略。另外,在未成熟病毒顆粒形成過程中,保守區(qū)域?qū)rM-E異質(zhì)二聚體的連接形成非常重要。目前已證實(shí)prM蛋白的保守區(qū)域是黃病毒裝配過程中的分子因素。4蛋白免