cd20與鈣離子內(nèi)流

cd20與鈣離子內(nèi)流

c20是人類b細胞表面的獨特特征，但d20在b細胞表面的生理影響尚不清楚。CD20在B淋巴細胞表面以寡聚體形式存在,現(xiàn)有實驗證明CD20在B細胞表面形成的是四聚體。CD20與B細胞抗原受體(Bcellantigenreceptor,BCR)的膜型IgM(sIgM)存在相互作用已經(jīng)被證實,B細胞活化后,BCR-CD20復(fù)合物會解離,磷蛋白、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白會暫時被招募到CD20,從而參與胞內(nèi)信號的傳導。鈣離子流動對細胞的生物學功能有重要影響,鈣池調(diào)控鈣離子進入(store-operatedcalciumentry,SOCE)通過鈣離子釋放激活的鈣離子(calcium-release-activatedcalcium,CRAC)通道來提高細胞內(nèi)的鈣離子濃度,是淋巴細胞提高胞內(nèi)鈣離子濃度的主要方式。越來越多的證據(jù)表明CD20參與了SOCE,CD20對于胞內(nèi)鈣離子濃度有重要的調(diào)節(jié)作用。1sd20和bcr1.1不同分離的b細胞bcrCD20分子屬疏水、4次跨膜蛋白,相對分子質(zhì)量(Mr)為33×103~35×103。CD20抗原表達于90%以上的B淋巴瘤細胞和正常的B淋巴細胞,而不表達于造血干細胞、原始B淋巴細胞、正常血細胞以及其他正常組織。BCR是一種由異源寡聚體形成的復(fù)合體。目前證實BCR至少由2部分組成,一部分為sIgM,另一部分為Igα和Igβ。BCR是B淋巴細胞發(fā)育、分化和活化的重要調(diào)節(jié)分子,有2個基本功能:一方面作為免疫效應(yīng)細胞直接參與免疫應(yīng)答,介導體液免疫;另一方面作為特異性的抗原提呈細胞選擇性地捕獲抗原并提呈給T細胞,協(xié)同和調(diào)節(jié)T細胞免疫應(yīng)答。1.2cd20t的表達Bubien等通過化學交聯(lián)細胞表面的蛋白分子,經(jīng)CD20免疫共沉,得到Mr分別為70×103和140×103的復(fù)合物,因為CD20單體的Mr為33×103~35×103,所以復(fù)合物可能是CD20的同源寡聚體。Deans等用標記的CD20和截短的CD20,通過免疫共沉淀證明CD20形成的是同源四聚體。為了檢測每一個寡聚物中CD20單體的數(shù)目,Deans等把一個C端缺少20個氨基酸殘基的截短的CD20(CD20TR)和天然的CD20分子(CD20WT)的cDNA共同轉(zhuǎn)染到HEK293細胞(5μgCD20WT的cDNA和15μgCD20TR的cDNA),使得CD20WT低表達,CD20TR高表達。通過免疫共沉淀(用抗-CD20C,抗CD20的C端的抗體)和免疫印跡(用抗-CD20N,抗CD20的N端的抗體)得到CD20WT與CD20TR條帶相對密度比例是3∶1,符合CD20能形成四聚體的推測。Deans等還用一個HA標記的CD20(CD20-HA)和CD20WT的cDNA共同轉(zhuǎn)染HEK293細胞,得到了相似的結(jié)果,2種分子的條帶相對密度比例也是3∶1,進一步證明了CD20同源四聚體的推測。值得注意的是,這種四聚體結(jié)構(gòu)在細胞表面的離子通道中很常見,這樣的結(jié)果使研究者們更加相信CD20就是一種鈣離子通道,但隨后的研究表明CD20自身并不形成離子通道。1.3cd20與bcr的相互作用通過用毛地黃皂苷(digitonin)溶解細胞,免疫共沉淀得到的CD20復(fù)合物Mr大于200×103,超過了CD20四聚體的大小(約140×103),表明CD20不僅能夠形成同源四聚體,還存在其他的分子與CD20相互作用。為了驗證細胞膜表面的其他何種分子與CD20相互作用,將BJAB細胞的膜蛋白用生物素標記,再裂解細胞,進行CD20的免疫共沉淀,用抗生物素蛋白進行免疫印跡,得到Mr分別約為80×103、68×103、45×103、35×103和29×103的5條帶。35×103條帶被證明是CD20分子;68×103的條帶不是在每一次試驗中都出現(xiàn),而且有時在對照泳道也出現(xiàn);45×103的條帶不確定(質(zhì)譜分析沒有結(jié)果);80×103和29×103條帶被證明分別是sIgM的重鏈(sIgμ)和輕鏈(sIgL)。換用Ramos細胞進行同樣實驗也得到了相同的結(jié)果。這些實驗結(jié)果表明CD20與BCR的sIgM存在相互作用。B細胞活化后,BCR-CD20復(fù)合物會解離,磷蛋白、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白會暫時被招募到CD20,從而參與胞內(nèi)信號的傳導。而且,CD20與sIgM結(jié)合不依賴膽固醇,但是其中有脂筏(lipidrafts)的參與。膽固醇存在于真核細胞的細胞膜上,其含量一般不超過膜脂的1/3。膽固醇在調(diào)節(jié)膜的流動性、增加膜的穩(wěn)定性,以及降低水溶性物質(zhì)的通透性等方面都起著重要的作用。脂筏是細胞膜上富含鞘磷脂和膽固醇的細胞膜微區(qū)。脂筏在B細胞活化的過程中起重要作用,可以作為BCR傳遞信號的一個平臺,也可能在抗原的傳遞過程中起作用。抗CD20的抗體結(jié)合到CD20以后引起了多種生物學效應(yīng),其中的一些生物學效應(yīng)是依賴于脂筏的。一些種類的蛋白被集中在脂筏中,如糖基磷脂酰肌醇連接蛋白(GPI-linkedprotein)、二乙酰化和十六烷?；鞍?如Lyn),還有G蛋白偶聯(lián)受體α亞基等,然而大多數(shù)的膜蛋白并不存在于脂筏中,如CD22和CD45。CD20組成性存在于脂膜中。BCR在B淋巴細胞靜息期被排除在脂筏之外,只有少量的BCR存在于脂筏中,此時BCR與脂筏的親和力很弱;但當BCR與抗原結(jié)合引起B(yǎng)CR自身寡聚化后,增加了BCR對于脂筏的親和力,BCR隨后就轉(zhuǎn)移到脂筏中。BCR由脂筏外轉(zhuǎn)移到脂筏上需要細胞膜上有膽固醇存在,這說明這種轉(zhuǎn)移很有可能依賴于脂筏的完整性,因此膽固醇是脂筏的一種重要組成成分。鑒于CD20和BCR都大量存在于脂筏中,那么CD20和sIgM的結(jié)合很有可能是在脂筏中完成的,因此Deans等試圖檢驗CD20和sIgM的結(jié)合是否依賴于脂筏中的主要成分之一———膽固醇。他們用甲基-β-環(huán)糊精(一種去除膽固醇的試劑)處理用生物素標記的Ramos細胞,用抗CD20單抗進行免疫共沉淀,用抗生物素蛋白進行免疫印跡。去除膽固醇的細胞和未去除的細胞得到了相同的結(jié)果。這說明CD20與sIgM的的結(jié)合是不依賴于膽固醇的,同樣也不依賴于脂筏的完整性。2細胞內(nèi)鈣離子跨膜電導用CD20的cDNA轉(zhuǎn)染不表達CD20的人類T細胞和小鼠前B類淋巴母細胞系,使2種細胞穩(wěn)定表達CD20分子,通過全細胞膜片鉗(whole-cellpatchclamp)和熒光顯微鏡檢查細胞膜的離子電導和細胞內(nèi)鈣離子活性,發(fā)現(xiàn)2種轉(zhuǎn)染后的細胞的鈣離子跨膜電導都有很大的提高;用CD20的cDNA轉(zhuǎn)染非淋巴細胞(人K562紅白血病細胞和小鼠NIH-3T3成纖維細胞)也得到了鈣離子跨膜電導的提高;用CD20單抗處理CD20+淋巴樣干細胞也增加了鈣離子跨膜電導。這種鈣離子跨膜電導增加的現(xiàn)象與用CD20的cDNA轉(zhuǎn)染細胞表現(xiàn)的電導特性是一樣的,這些都說明CD20參與了B淋巴細胞的鈣離子的流動,CD20在B淋巴細胞功能表達中扮演重要角色。2.1cd20自身對鈣離子流動的誘導CD20的結(jié)構(gòu)與一些離子通道很相似:每一個CD20單體都是4次跨膜,分子的N端和C端都在細胞質(zhì)一側(cè),能形成多聚體。這些事實表明CD20可能直接調(diào)控B細胞跨膜鈣離子電導,而且CD20的多聚體可能在B淋巴細胞膜上形成鈣離子通道。Janas等即認為鈣離子的流動源于CD20在細胞膜上形成的鈣離子通道。然而,Unruh等卻認為鈣離子流動源自細胞內(nèi)鈣庫的鈣離子釋放。為了驗證這2種說法的正確性,Cragg等下調(diào)Ramos細胞BCR的表達,或使Ramos細胞不表達BCR,當用抗CD20的抗體作用這些Ramos細胞時不能誘導鈣離子流。很明顯,如果CD20自身能形成鈣離子通道,用抗CD20的抗體作用Ramos細胞是應(yīng)該有鈣離子的流動的,然而當Ramos細胞不表達BCR時,抗CD20的抗體作用Ramos細胞沒能誘導鈣流,這說明抗CD20抗體引起的鈣離子流動并不是依靠CD20自身形成的離子通道來完成的。也就是說Unruh等的觀點是正確的,鈣離子流動源自細胞內(nèi)鈣庫的鈣離子釋放,它源于CD20與BCR的相互作用,而不是CD20四聚體自身形成鈣離子通道。2.2su-統(tǒng)一的抗cd20抗體的誘導表達適當?shù)目笴D20單抗都有能力提供有效的依賴抗體的細胞毒性(ADCC)效應(yīng),而且這些抗體在產(chǎn)生ADCC效應(yīng)方面沒有任何差別。但基于這些抗體把CD20分配進入去污劑不溶的膜區(qū)域的能力、誘導同型細胞黏附以及誘導CDC效應(yīng)的不同,這些抗體能分為2個類型,即Ⅰ型(如rituximab、2F2)和Ⅱ型(如B1、11B8)。分別用Ⅰ型和Ⅱ型抗CD20抗體誘導SU-DHL-4細胞系(一種濾泡淋巴瘤細胞),結(jié)果Ⅰ型能夠誘導鈣流,而Ⅱ型不能。然而當用其他的細胞系,如Unruh等用2種類型的抗體誘導Ramos淋巴瘤細胞鈣流時,Ⅰ型和Ⅱ型的抗CD20抗體都沒有誘導Ramos細胞產(chǎn)生鈣流;但當加入高交聯(lián)劑(hypercrosslinker,抗Fc片段的試劑)后,Ⅰ型抗CD20抗體產(chǎn)生了鈣流,而Ⅱ型沒有產(chǎn)生。對于是否需要高交聯(lián)劑來輔助Ⅰ型抗CD20抗體產(chǎn)生鈣流,Cragg等認為取決于CD20在B淋巴細胞上的表達水平。SU-DHL-4細胞表達的CD20數(shù)量是其他正常B淋巴細胞或B淋巴瘤細胞的3~5倍,表明SU-DHL-4細胞高表達CD20可能使其在被誘導鈣離子流動時不需要加入高交聯(lián)劑。為此用CD20特異的小干擾RNA(siRNA)來降低SU-DHL-4細胞CD20的表達,這時只加入Ⅰ型抗CD20抗體就不產(chǎn)生鈣流,而當進一步加入高交聯(lián)劑時鈣流出現(xiàn)。其他的B淋巴瘤細胞(如Raji、BL60、Ramos)和正常的B淋巴細胞在用Ⅰ型抗CD20抗體誘導產(chǎn)生鈣流時都需要高交聯(lián)劑的存在,SU-DHL-4細胞可能只是一個特例,絕大多數(shù)B淋巴細胞在誘導鈣流時都需要高交聯(lián)劑。2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲藏的鈣離子釋放與soce相互作用SOCE是淋巴細胞提高胞內(nèi)鈣離子濃度的主要方式。SOCE對于B淋巴細胞和T淋巴細胞的活化以及細胞因子的表達都起到重要的作用。越來越多的證據(jù)表明CD20參與了SOCE。例如前文提到的不表達CD20的人類T細胞和小鼠前B類淋巴母細胞系,當使它們異位表達CD20時,這些細胞內(nèi)的鈣流水平顯著提高。當BCR與抗原結(jié)合后,通過一系列的磷酸化反應(yīng),使磷脂酶C-γ2活化,進而使質(zhì)膜上的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解為1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG),IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放到細胞質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)儲藏的鈣離子的耗盡,觸發(fā)了第二期的胞外的鈣離子流入,這個過程是依靠SOCE來完成的。SOCE過程需要2種關(guān)鍵元件:間質(zhì)相互作用分子1(stromainteractionmolecule,STIM1)和ORAI1(也稱作CRACM1)。根據(jù)目前的SOCE模型,由信號分子IP3誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體(IP3R)通道打開,導致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲藏的鈣離子釋放,鈣離子濃度降低。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲藏的鈣離子被耗盡后,STIM1分子被活化、移動到CRAC通道附近,通過與CRAC通道相互作用,改變CRAC構(gòu)象,進而打開細胞膜上的CRAC通道,提高胞內(nèi)的鈣離子濃度。CRAC通道由一個或多個ORAI1家族蛋白構(gòu)成。ORAI1是一種4次跨膜蛋白,N端和C端在胞內(nèi),其91位精氨酸殘基突變?yōu)樯彼釟埢梢詫е翪RAC功能的缺失,表現(xiàn)為患重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)。STIM1為單次跨膜分子,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,其N端包含一個和鈣離子結(jié)合的EF手基序(EF-handmotif),有帶負電荷的殘基(D76、D78和E87),這3個位點對于其感受鈣離子濃度是至關(guān)重要的。SOCE通過CRAC通道引起的細胞外的鈣離子內(nèi)流,使得鈣離子信號得到維持,而不至于因為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲藏的鈣離子耗盡而消失。而且當刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放的因素減退,這些胞外流入的鈣離子還可以儲存進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?？傊?SOCE對鈣離子信號具有重要的調(diào)節(jié)作用,SOCE所引起鈣離子流的強度和持續(xù)時間,由鈣敏感蛋白轉(zhuǎn)化成為不同的基因的表達,從而決定了受體與抗原結(jié)合后細胞的命運。3cd20的生物學功能很長一段時間以來,CD20僅僅作為B淋巴細胞表面特有的標志物,生產(chǎn)抗CD20的單克隆抗體用于淋巴瘤的治療。雖然抗CD20的單克隆抗體在治療淋巴瘤方面取得了很大的成就,但是對于CD20的生物學功能研究進展緩慢,與其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域取得的巨大成就形成鮮明的對比。近些