制川烏與甘草配伍對單酯型生物堿煎出量的影響

制川烏與甘草配伍對單酯型生物堿煎出量的影響

四川烏是科維托科植物的四川烏。制川烏味辛、苦、熱,有毒;具有祛風除濕、溫經止痛的功效,主要用于風寒濕痹、關節(jié)冷痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛。制川烏的主要成分為二萜型生物堿,其中量最高的是以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿為代表的C19單酯型生物堿,單酯型生物堿是雙酯型生物堿水解脫去乙?；漠a物。現(xiàn)代藥理學研究表明,雙酯型生物堿既是川烏和制川烏的有效成分,又是其毒性成分,其水解產物單酯型生物堿在保留了雙酯型生物堿藥理活性的同時毒性降為原來的1/200。由于川烏和制川烏均為有毒藥材,因此在使用時常同甘草或白芍等藥味配伍使用以達到減毒的作用。以往配伍研究多集中在雙酯型生物堿,對單酯型生物堿量變化的研究則較少,本實驗旨在通過研究制川烏與甘草不同配伍比例下3種有代表性的單酯型生物堿的煎出量,找出不同配伍比例的影響和變化規(guī)律,以指導制川烏的臨床應用。1藥物、試劑與儀器MF10basic粉碎機(德國IKA集團);Agilent1200液相色譜儀,配有四元低壓梯度混合系統(tǒng)、二極管陣列檢測器(美國Agilent公司);XS205分析天平,MAX81g/220g,d=0.01mg/0.1mg(瑞士MetterToledo公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。乙腈、四氫呋喃、異丙醇(均為色譜純,德國Merck公司),無水乙醇、醋酸銨、醋酸(均為分析純,天津市化學試劑一廠),三氯甲烷(色譜純,天津市康科德科技有限公司),二純水(Milli-Q制備),蒸餾水(自制)。苯甲酰烏頭原堿(批號PCM-CW-04-20100902)、苯甲酰次烏頭原堿(批號PCM-CW-05-20100925)、苯甲酰新烏頭原堿(批號PCM-CW-06-20101110),均購自天津馬克生物技術有限公司,HPLC面積歸一化測定質量分數(shù)均大于98%。制川烏飲片、甘草飲片購自安國市藥材市場,經中國藥科大學馮鋒教授鑒定,分別為毛莨科植物川烏AconitumcarmichaeliDebx.干燥母根的炮制品、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根莖。制川烏粉碎成最粗粉(全部通過1號篩),備用。2方法和結果2.1chocolh4-u色譜柱為AgilentZorbaxSB-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為CH3CN-THF(5∶3,A)-0.1mol/LCH3COONH4水溶液(每1000mL加入0.5mLCH3COOH,B),梯度洗脫:0~48min,15%~26%A;48~49min,26%~35%A;49~58min,35%A;58~65min,35%~15%A;體積流量1.0mL/min;柱溫30℃;檢測波長235nm;進樣量10μL。制川烏配伍甘草合煎液譜圖及甘草陰性樣品譜圖見圖1,陰性樣品在相應位置無干擾。2.2混合對照品儲備液的制備精密稱取苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對照品適量,加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液制成含苯甲酰新烏頭原堿150.44μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿152.70μg/mL、苯甲酰烏頭原堿55.27μg/mL的混合溶液,作為混合對照品儲備液,備用。2.3試驗溶液的制備2.3.1樣品的制備及色譜條件的測定稱取50g制川烏粗粉,加入10倍量50%乙醇溶液,加熱回流,從溶液沸騰時開始計時,在0.5h時停止加熱,迅速冷卻,濾過,取續(xù)濾液10mL,用等量乙醚洗滌1次,棄去乙醚層,再加入2mL濃氨水,混勻,用10mL乙醚萃取2次,合并萃取液,減壓常溫濃縮至干,殘渣用異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液溶解,定容到2mL,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,照“2.1”項下色譜條件測定。2.3.2乙醇溶液的配制稱取制川烏粗粉50g,分別配伍甘草12.5、25、50、75、100g,按照“2.3.1”項下方法,自“加入10倍量50%乙醇溶液”起操作。2.3.3陰性樣品的制備稱取50g甘草飲片,按照“2.3.1”項下方法,自“加入10倍量50%乙醇溶液”起操作。2.4新頭皮原堿y計算分別吸取混合對照品儲備液2、4、6、8、10mL置10mL量瓶中,用異丙醇-三氯甲烷(1∶1)定容,進樣檢測。分別以峰面積為縱坐標(Y),生物堿質量分數(shù)為橫坐標(X)進行線性回歸,得回歸方程:苯甲酰新烏頭原堿Y=11.874X-84.269,r=0.9999;苯甲酰次烏頭原堿Y=10.619X-57.233,r=0.9999;苯甲酰烏頭原堿Y=10.619X-57.233,r=0.9994。表明苯甲酰新烏頭原堿在0.30~3.00μg、苯甲酰次烏頭原堿在0.31~3.10μg、苯甲酰烏頭原堿在0.11~1.10μg線性關系良好。2.5不同原堿苯甲酰次頭皮原堿穩(wěn)定性的測定按“2.1”項下色譜條件,重復進樣混合對照品儲備液6次,測定峰面積,計算其RSD,分別為苯甲酰新烏頭原堿0.9%、苯甲酰次烏頭原堿1.1%、苯甲酰烏頭原堿0.9%。2.6不同種原堿進樣rsd的測定取制川烏甘草合煎供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件,分別在0、4、8、12h時進樣,測定峰面積,計算其RSD,分別為苯甲酰新烏頭原堿1.5%、苯甲酰次烏頭原堿3.9%、苯甲酰烏頭原堿2.9%。表明樣品在12h內基本穩(wěn)定。2.7溶液質量分數(shù)的測定取制川烏粗粉50g6份,每份配伍甘草50g,按“2.3.2”項下方法平行處理,按照“2.1”項下色譜條件測定峰面積,計算各成分質量分數(shù)的RSD,分別為苯甲酰新烏頭原堿4.2%、苯甲酰次烏頭原堿3.9%、苯甲酰烏頭原堿3.1%。2.8混合對照品溶液取制川烏甘草合煎溶液6份,每份10mL。分別加入相當于合煎液樣品量100%的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿混合對照品,按照“2.3.1”項下方法,自“用等量乙醚洗滌1次”起操作。計算得回收率分別為苯甲酰新烏頭原堿98.5%(RSD為2.3%),苯甲酰烏頭原堿96.1%(RSD為4.1%),苯甲酰次烏頭原堿97.8%(RSD為1.9%)。2.9甘草配伍對單酯型衍生物的影響制川烏單煎液及與甘草合煎液中各單酯型生物堿量結果見表1。以制川烏單煎液中3種生物堿的量為1,計算不同配比煎出液中3種生物堿對單煎液中3種生物堿的比值,結果見圖2。從表1和圖2中可以看出,隨著甘草配伍量的增加,3種單酯型生物堿總量均逐漸減少。在甘草配伍量小于制川烏量的一半時,單酯型生物堿減少速率較快;在甘草配伍量大于制川烏的一半時,單酯型生物堿減少速率較慢,且有趨向定值的趨勢。由此變化規(guī)律來看,當甘草使用量為制川烏的一半以上時,即可使溶液中的單酯型生物堿穩(wěn)定在單煎煎出量的40%。3討論3.1不可重視的毒性制川烏中主要含單酯型生物堿,其毒性較川烏中所含的雙酯型生物堿小,但是在實際應用中亦不可忽視其毒性。本研究中雙酯型生物堿在藥材中、單煎液和合煎液中由于炮制和合用的減毒效果使雙酯型生物堿發(fā)生分解轉化等變化,使其量顯著降低,均無法檢出,因此不將雙酯型生物堿作為考察對象,而是將制川烏中所含量最多的3種單酯型生物堿作為考察對象。3.2不同復方制劑中單酯型衍生物的部分最佳劑量測定在前期試驗中分別考察了藥材粉碎程度、煎煮時間、溶劑倍數(shù)、溶劑種類對制川烏中生物堿溶出量的影響,發(fā)現(xiàn)藥材粉碎程度、煎煮時間和溶劑倍數(shù)對生物堿溶出影響不大,溶劑種類是主要影響因素。在50%乙醇溶液中可以煎出最多的生物堿,因此選擇將藥材粉碎成最粗粉,加入10倍量50%乙醇,煎煮0.5h作為煎煮條件。通過對照品水解試驗發(fā)現(xiàn),單酯型生物堿在50%乙醇溶液中較穩(wěn)定,因此使用50%乙醇不但可以煎出最多的生物堿,又能夠保證單酯型生物堿的穩(wěn)定。制川烏和甘草合煎液中成分復雜,直接測定時甘草有干擾,無法準確測定單酯型生物堿的量。進一步測定溶液pH值發(fā)現(xiàn),煎煮液pH值均在4~5,生物堿在溶液中以離子形式存在,因此先用乙醚洗去大量脂溶性雜質,再加氨水堿化萃取生物堿可以得到較準確的結果。從《中國藥典》2010年版收錄的多種復方制劑來看,共有骨刺丸、骨刺消痛丸等4種制劑使用到了制川烏