質粒pxm1表達及perfp表達質粒的構建

質粒pxm1表達及perfp表達質粒的構建

多頭毛蟲是一種具有中等以上粒密度的嗜菌性。它的生命周期包括單殼菌、多核原質團和它們的形成。其中,原質團是多頭絨泡菌的主要生命形態(tài),也是一種多核體細胞(非細胞結構,無胞壁,僅原生質膜)。多頭絨泡菌的有絲分裂沒有G1期,只有S期、G2期和M期,DNA合成始于有絲分裂末期結束。原質團內的基因復制與轉錄以及其他細胞生物學事件都是按同步化方式進行的。原質團在同步化培養(yǎng)20h后進入第一次同步有絲分裂中期;第一次至第二次有絲分裂中期的原質團生長最快、同步化效果最好;是研究細胞周期變化的好材料。在前期研究中,先后從多頭絨泡菌cDNA文庫中分離出一個SR蛋白激酶(PhysarumSRPK,PSRPK)基因和一個14-3-3蛋白(P14-3-3)基因,之后又以PSRPK和P14-3-3為餌蛋白,通過酵母雙雜交分離出200余個cDNA片段及50余個完整的cDNA。生物信息學分析結果顯示,上述基因編碼的蛋白涉及多頭絨泡菌的多個生命過程。由于缺少合適的多頭絨泡菌表達系統(tǒng),制約了上述蛋白的細胞生物學研究。因此,構建多頭絨泡菌微原質團的表達質粒、建立質粒轉化方法和表達產物的檢測方法對多頭絨泡菌基因表達及蛋白的生理功能研究具有重要意義。多頭絨泡菌ardCactin基因上游的1082bp片段內含有ardCactin基因的啟動子PardC和一個DNA復制子。本研究用PardC(GenBankAccessionNo.M73459)和ardCactin基因終止子TardC(GenBankAccessionNo.M73460)分別替換質粒pDsRed1-N1的CMVIE和SV40polyA片段,構建了多頭絨泡菌的RFP表達質粒pXM1;通過改造質粒pTB38,引入RFP基因序列,構建了多頭絨泡菌RFP表達質粒pXM2;將多頭絨泡菌轉錄延伸因子(Transcriptionelongationfactor1,ELF1)類似蛋白(PhysarumELF1,PELF1)基因與pXM2重組,構建了PELF1的紅色熒光融合蛋白表達質粒pXM2-pelf1。通過熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察RFP的表達,確定了質粒pXM1和pXM2的表達功能以及多頭絨泡菌微原質團的電轉條件。通過觀察疑似核蛋白PELF1的核定位,印證了該瞬時表達系統(tǒng)的可信性。1材料和方法1.1基于pef1的elf1蛋白及協(xié)同分子身份證分析P14-3-3是從多頭絨泡菌TU291菌株(由法國Reims大學細胞生物學實驗室惠贈)分離的1個14-3-3蛋白,PELF1是以P14-3-3C-端的181個氨基酸殘基為餌蛋白,通過酵母雙雜交從多頭絨泡菌TU291菌株cDNA文庫分離的1個ELF1類似蛋白,其完整cDNA的GenBank序列號為NoFJ422212。1.2紅色熒光融合蛋白表達質粒的構建以質粒pTB38(由加拿大Wisconsin大學McArdle實驗室GerardPierron惠贈)為模板,用引物F1/R1(表1)PCRPardC1片段。通過AseI、BglII內切酶和T4DNA連接酶(TaKaRa),用PardC替換質粒pDsRed1-N1(Clontech)的pCMVIE片段;轉化EcoliDH5α,制備過渡質粒pXM。以質粒pTB38為模板,用引物F2/R2(表1)PCRTardC1片段;以TardC1片段為模板,用引物F3/R3(表1)PCR擴增C25突變?yōu)镚25的mTardC片段。通過NotI和AflII內切酶(TaKaRa),用mTardC替換pXM上的SV40polyA片段;制備成紅色熒光蛋白表達質粒pXM1(圖1)。以pDsRed1-N1為模板,用引物F4/R4(表1)PCRDsRed1片段;以pTB38為模板,用引物F5/R5(表1)PCR擴增PardC2片段,用引物F6/R6(表1)PCR擴增TardC2片段;之后再用引物F7/R7(表1)overlap-PCR擴增DsRed1和TardC2片段;通過KpnI酶切PardC2和DsRed1-TardC2片段,并連接成含MCS(KpnI、SmaI和SalI)的表達盒PardC-MCS-DsRed1-TardC;通過HindIII和SacI酶切酶,用PardC-MCS-DsRed1-TardC替換pTB38的PardC-hph-TardC片段;轉化E.coliDH5α,制備成紅色熒光表達質粒pXM-2(圖2)。以質粒pGADT7-pelf1為模板,用引物F8/R8(表1)PCR擴增PELF1基因片段,之后重組到pXM2對應位點上,轉化E.coliDH5α后,制備成PELF1紅色熒光融合蛋白表達質粒pXM2-pelf1。通過酶切和測序確認質粒pXM1、pXM2和pXM2-pelf1重組序列的正確。1.3重組菌pporad-amesb貯液的制備參照Daniel等的方法,在250mL三角燒瓶中,加入20mLSDM的A貯液(1000mL溶液含Glucose10g,DifCoBactoSoytone10g,CitricAcidmonohydrate3.54g,KH2PO42g,CaCl2·2H2O1.026g,MgSO4·7H2O0.6g,ZnSO4·7H2O0.034mg,ThiamineHCl0.0424mg,Biotin0.0158mg,用4mol/L的KOH調整pH至4.6)、0.2mLSDM的B貯液(含0.05%hematin和1%NaOH(W/V)和1%多頭絨泡菌(PpolycephalumPpII(+/-)strain,ATCC編號為24467由德國雷根斯堡大學生物物理學所惠贈)微原質團(W/V),在260r/min、24~26oC下暗培養(yǎng),每3d傳代1次。參考Burland等電轉化Physarumamoebae的方法,取懸浮培養(yǎng)48~72h、直徑小于500μm的微原質團,在2000r/min下離心2min,用等體積ZAPP液(40mmol/LSucrose,10mmol/LHEPES,pH8.2)洗滌,用ZAPP液重懸,之后在4oC下過夜。取800μL直徑小于500μm的多頭絨泡菌微原質團液懸液(約0.5×104~1×104個)和5μg質粒溶液,在直徑為4mm的BioRad電轉杯中混勻,冰浴后按表2的參數(shù),在Multiporator?電轉儀(EppendorfAG)上進行電轉化。將多頭絨泡菌微原質團轉移到EP管中,在30oC水浴中復蘇20min。取800μL復蘇的電轉化微原質團滴加到10mLSDM培養(yǎng)基中,24oC~26oC下暗培養(yǎng)8h后,每隔8h取1mL菌液,2000r/min離心4min后,用無菌蒸餾水清洗2次并壓片,通過熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達情況。1.4物理面為0.3%的合成取少量液體培養(yǎng)的多頭絨泡菌于載玻片上,加一滴卡寶品紅染液[45mL品紅母液(0.3g堿性品紅,10mL70%乙醇,90mL5%苯酚(W/V)),6mL冰醋酸和6mL37%甲醛的混合液]于菌體上,之后在OlympusBX51顯微鏡下(可見光)觀察、拍照。1.5文化蛋白表達分析在熒光顯微鏡(OlympusBX51)下觀察質粒電轉化多頭絨泡菌微原質團后紅色熒光蛋白(RFP)及PELF1-RFP的表達情況,之后通過激光掃描共聚焦顯微鏡(TCSSP2,Leica),在558nm激發(fā)波長下560~600nm范圍內觀察RFP或PELF1-RFP的表達或分布。2結果2.1dna片段中n-q通過酶切和瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒pXM1、pXM2和pXM2-pelf1的重組序列。圖3顯示,用AseI和BglII酶切pXM1,產生一個與PardC大小一致的DNA片段;用NotI和AflII酶切質粒pXM1,產生一個與TardC大小一致的DNA片段;說明PardC和TardC片段存在于質粒pXM1上。用HindIII和SacI酶切質粒pXM2,產生一個與PardC-MCS-DsRed1-TardC大小一致的DNA片段,說明PardC-MCS-DsRed1-TardC存在于質粒pXM2上。用KpnI和SacI酶切質粒pXM2-pelf1,產生一個與PELF1基因大小一致的DNA片段,說明PELF1基因存在于質粒pXM2-pelf1上。質粒pXM1、pXM2和pXM2-pelf1的測序結果進一步證實,PardC和TardC分別替換了質粒pDsRed1-N1的CMVIE和SV40polyA,PardC-MCS-DsRed1-TardC替換了質粒pTB38的PardC-hph-TardC,PELF1基因正確插入到pXM2的KpnI和SacI的酶切位點間,說明上述3個質粒的構建是成功的。2.2膜原質團內的紅色熒光分別取5μg測序確認的質粒pXM1和pXM2電轉化(電轉參數(shù)為4kV/cm、1A、70μs)多頭絨泡菌微原質團(≤500μm),36h后用熒光顯微鏡(OlympusBX51)和激光掃描共聚焦顯微鏡(LeicaTCSSP2)觀察紅色熒光蛋白在多頭絨泡菌微原質團內的表達,發(fā)現(xiàn)2個轉化菌內均有紅色熒光出現(xiàn)(圖4);說明由PardC啟動、TardC終止的紅色熒光蛋白表達質粒pXM1和pXM2均能在多頭絨泡菌微原質團中表達外源基因。2.3微原質團的熒光顯微鏡檢測按表2的電轉參數(shù),分別將5μg質粒pXM2電轉到800μL多頭絨泡菌微原質團中,8h后觀察多頭絨泡菌的生長變化,發(fā)現(xiàn)電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、60μs,4.0kV/cm、1.00A、70μs和5.0kV/cm、1.25A、60μs時,菌體生長基本正常,形態(tài)沒有明顯改變(見表2),培養(yǎng)36h后,可以在熒光顯微鏡下觀察到RFP的表達(圖5);其中,電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、70μs時,熒光最顯著。而電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、75μs和5.5kV/cm、1.38A、60μs時,菌體培養(yǎng)30h后出現(xiàn)死亡(表2);說明多頭絨泡菌微原質團的最佳電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、70μs。通過跟蹤觀察轉基因微原質團的熒光強度變化,發(fā)現(xiàn)質粒pXM2轉化多頭絨泡菌的24h內,只有微量RFP表達,48h后熒光強度明顯降低,72h后基本觀察不到熒光,說明質粒在多頭絨泡菌表達的最佳觀察時間為電轉化后的24~48h。此外,還將線性質粒pXM2及表達盒PardC-red-TardC電轉化到多頭絨泡菌微原質團中(電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、70μs),36h后分別在熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白在多頭絨泡菌微原質團的表達情況。與環(huán)型質粒pXM2不同,線性質粒pXM2及表達盒PardC-red-TardC均不能在多頭絨泡菌中看到紅色熒光蛋白表達,說明只有環(huán)型質粒能在多頭絨泡菌中表達外源基因。2.4perf1基因序列的鑒定本課題組從多頭絨泡菌分離的ELF1類似蛋白cDNA含有565個核苷酸,編碼100個氨基酸。編碼序列與人(Homosapiens)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ELF1蛋白(GenBankAccessionNos.分別為NP_115753、NP_568654和NP_012762)序列高度同源(圖6),本研究將其命名為PELF1(PhysarumELF1)。SWISS-MODEL軟件模擬的三級結構圖譜顯示,PELF1與其他物種ELF1一樣,也是一個鋅指蛋白,鋅指結構域內也存在4個保守的半胱氨酸(圖6內*標記的氨基酸)。PSORTII軟件分析結果顯示,PELF1N-端還存在一個經典的核定位信號序列(序列比對圖譜中下劃線標記的肽段),說明PELF1可能是一個核蛋白,可以用于觀察紅色熒光融合蛋白在多頭絨泡菌內的表達分布。將質粒pXM2-pelf1電轉化到多頭絨泡菌微原質團(電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、70μs),培養(yǎng)36h后,在熒光顯微鏡下初步觀察PELF1-RFP在多頭絨泡菌內的表達情況,再通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察PELF1-RFP在多頭絨泡菌細胞內的分布,結果見圖7。參考多頭絨泡菌細胞核在原質團內的分布(圖7C)可以看出,pXM2-pelf1在多頭絨泡菌表達的PELF1-RFP在核內外均有分布(圖7B),但核內的分布密度更高,說明PELF1是一個核蛋白。上述結果也說明,質粒pXM1、pXM2和pXM2-pelf1電轉化多頭絨泡菌微原質團后,通過熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到的紅色熒光是由RFP或PELF1-RFP發(fā)射光產生的。3質粒pxm2表達多頭絨泡菌有4個actin基因,其中,ardCactin基因的復制發(fā)生在有絲分裂早S期。Burland等發(fā)現(xiàn),ardCactin基因上游的1082bp片段(PardC)內不僅含有ardCactin基因的啟動子還含有一個復制子。Burland等將PardC片段重組在酵母表達質粒pGEM-7Zf(+)的pSP6啟動子下游,并在PardC和pT7之間分別插入了氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因、潮霉素磷酸轉移酶(HPH)基因和螢火蟲熒光素酶(LUC)基因,構建了CAT、HPH和LUC表達質粒;將上述質粒電轉化到多頭絨泡菌變形體后,能檢測到CAT、HPH和LUC的瞬時表達;說明以質粒pGEM-7Zf(+)為基礎構建的,PardC啟動的質粒能在多頭絨泡菌變形體內表達外源基因。Burland等還在pGEM-7Zf(+)的基礎上構建了PardC啟動的、ardCactin基因終止子TardC終止的HPH表達質粒pTB38,并發(fā)現(xiàn)環(huán)型和線型pTB38都能在多頭絨泡菌變形體內瞬時表達PHP。本研究構建的多頭絨泡菌紅色熒光蛋白表達質粒pXM2(圖2)去掉了質粒pTB38的HPH基因,增加了紅色熒光蛋白(RFP)基因和多個多克隆位點,主要用于多頭絨泡菌瞬時表達紅色熒光融合蛋白。pDsRed1-N1是哺乳動物細胞的紅色熒光融合蛋白瞬時表達質粒。在構建多頭絨泡菌瞬時表達質粒pXM1時,用PardC和TardC分別替換了質粒pDsRed1-N1的CMVIE序列和SV40polyA序列,保留了MCS序列和DsRed1序列(圖1),以便質粒pXM1能在多頭絨泡菌中表達紅色熒光蛋白或紅色熒光融合蛋白;保留了pUCori序列和Kan/Neo序列,以便質粒pXM1在大腸桿菌中克隆;保留了f1噬菌體的復制起始序列f1ori,以便制備質粒pXM1的單鏈DNA,使得pXM1具備了表達質粒的基本功能。多頭絨泡菌變形體是由孢子萌發(fā)產生的單倍體細胞,沒有細胞壁,沒有固定形狀,但能伸出假足捕食細菌或其他顆粒狀食物,因此被Burland等選作質粒轉化的感受態(tài)細胞。單倍體變形體需要結合成雙倍體合子后才能聚集成原質團,以變形體作為質粒的宿主細胞,適合觀察多頭絨泡菌的發(fā)育及分化,不適合研究多頭絨泡菌的細胞周期變化。多頭絨泡菌原質團是觀察細胞周期變化和蛋白分布的最佳生命形態(tài),因此本研究選擇小于500μm的微原質團作為質粒轉化的宿主細胞,研究了質粒pXM2電轉化多頭絨泡菌微原質團的條件。通過熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察紅色熒光蛋白在原質團內的表達發(fā)現(xiàn),在電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、60μs,4.0kV/cm、1.00A、70μs和5.0kV/cm、1.25A、60μs的多頭絨泡菌原質團中,能觀察到質粒pXM2表達的RFP(圖5);其中,電轉參數(shù)為4.0kV/cm、1.00A、70μs的多頭絨泡菌原質團中RFP的熒光強度最大;說明在合適的條件下,可以將質粒電轉化到多頭絨泡菌微原質團內表達。在電轉參數(shù)為4kV/cm、1.00A、70μs時,將質粒pXM1轉化到多頭絨泡菌微原質團內,也能觀察到RFP的表達(圖4),說明質粒pXM1與質粒pXM2一樣,都能在多頭絨泡菌原質團內表達外源基因。除了上述研究外,還觀察了線性pXM2在多頭絨泡菌原質團的表達,沒有在熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到RFP的表達,說明線性質粒不能像在變形體細胞一樣在原質團內表達