運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的影響

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的影響

脊柱損傷（rci）以“高發(fā)病率、高致殘率、低死亡率”為特征，給社會(huì)家庭帶來(lái)嚴(yán)重壓力。自Aguayo等證明中樞神經(jīng)有一定的再生能力后,脊髓損傷的治療思路由神經(jīng)保護(hù)轉(zhuǎn)向促進(jìn)神經(jīng)再生,即促進(jìn)損傷神經(jīng)元和支持細(xì)胞的存活或替換;通過(guò)軸突再生和重塑,形成新的神經(jīng)回路,部分代償喪失的神經(jīng)功能。然而,神經(jīng)生長(zhǎng)是中樞神經(jīng)再生環(huán)境中各種因素交互作用的結(jié)果,脊髓損傷后再生困難與缺乏合適的微環(huán)境有關(guān)。中樞神經(jīng)元再生困難主要原因不是神經(jīng)元本身,而是中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境不適合軸突再生。神經(jīng)再生環(huán)境的“允許”作用表現(xiàn)為內(nèi)在再生能力超過(guò)再生抑制作用且有軸突生長(zhǎng)的正確導(dǎo)向。已有研究發(fā)現(xiàn),脊髓不完全損傷的大鼠脊髓內(nèi)存在自發(fā)的神經(jīng)回路重建。外周神經(jīng)損傷后環(huán)境中大量軸突再生相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào);如無(wú)外周神經(jīng)預(yù)損傷,則基因表達(dá)不上調(diào)。提示中樞神經(jīng)在一定條件下可以再生,且這種再生條件具有可誘導(dǎo)性。近年來(lái),康復(fù)訓(xùn)練已廣泛用于改善患者殘肢功能,但其對(duì)神經(jīng)再生的作用報(bào)道較少。本研究對(duì)比觀察自然狀態(tài)下和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后,脊髓損傷后大鼠在運(yùn)動(dòng)功能上的變化,以及在脊髓內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、誘導(dǎo)軸突分化因子Slit2、星型膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)規(guī)律,以了解康復(fù)訓(xùn)練對(duì)損傷后脊髓微環(huán)境的影響,探討其治療脊髓損傷的可能機(jī)制。1材料和方法1.1兔抗大鼠腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子和純化抗體包括資金、培養(yǎng)基等的免疫健康雄性SD大鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,體重320~350g。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20~24℃,相對(duì)濕度50%,自由飲食,分籠喂養(yǎng)。兔抗大鼠腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子親和純化抗體;兔抗大鼠Slit2親和純化抗體;兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白親和純化抗體(均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)。兔二步法檢測(cè)試劑盒(PV-6001)、小鼠二步法檢測(cè)試劑盒、DAB顯色液(均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。1.2方法1.2.1分組和治療方法健康雄性SD大鼠70只,隨機(jī)分為10個(gè)實(shí)驗(yàn)組和4個(gè)對(duì)照組(每組5只)。實(shí)驗(yàn)組包括4個(gè)遞增的訓(xùn)練時(shí)程:訓(xùn)練1周(4組共20只)、訓(xùn)練2周(3組共15只)、訓(xùn)練3周(2組共10只)、訓(xùn)練4周(5只)。1.2.2不完全性髓傷模型的建立5%水合氯醛0.7ml/100g腹腔注射,麻醉后暴露胸10棘突,用止血鉗咬去棘突及椎弓板,暴露脊髓。采用改良Allen’s撞擊法,用10g重錘,沿一固定的中空細(xì)玻璃管自4cm高處垂直落下,致傷能量為10g×4cm,造成不完全性脊髓損傷模型。以傷后出現(xiàn)鼠尾痙攣為造模成功的標(biāo)志。術(shù)后1~3天每天予青霉素20萬(wàn)U/只肌肉注射,預(yù)防感染。在脊髓損傷后1周內(nèi)進(jìn)行膀胱按摩,促進(jìn)排尿,每天2次。1.2.3大鼠被動(dòng)進(jìn)入活動(dòng)患1.2次損傷后7天開始,用自制裝置將實(shí)驗(yàn)組大鼠懸吊固定于活動(dòng)平板上,平板啟動(dòng)后大鼠被動(dòng)爬行活動(dòng)患肢,每日2次,每次5min。每組于訓(xùn)練結(jié)束后第1、2、3、4周(即損傷后14、21、28、35天)分別取材5只。1.2.4下肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)估造模前及造模后每周進(jìn)行1次改良Tarlov評(píng)分和Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分。評(píng)分均為2人合評(píng)。1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)4%多聚甲醛心臟灌注固定后取大鼠T12~L1節(jié)段脊髓,經(jīng)固定、脫水、透明,石蠟包埋、切片。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組織化學(xué)二步法染色。1.2.6中央管周圍視野每只大鼠取1張切片,每張切片取腹角、背角、及中央管周圍3個(gè)視野。使用Image-ProPlus5.0軟件進(jìn)行圖像分析,比較不同組大鼠脊髓內(nèi)陽(yáng)性神經(jīng)元染色的平均積分光密度A值。1.3t檢驗(yàn)和最小顯著差法數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS16.0軟件分析,兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn),多組均數(shù)比較用最小顯著差法(LSD法)。P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1兩組talrov評(píng)分比較正常大鼠改良Tarlov評(píng)分為5分。損傷后第1天大鼠雙側(cè)后肢完全癱瘓,評(píng)分為0。損傷后7天為功能恢復(fù)上升期,此時(shí)開始運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,除訓(xùn)練1周組在損傷后14、21、28、35天Tarlov評(píng)分與對(duì)照組比較,P>0.05外,訓(xùn)練2~4周組各時(shí)間點(diǎn)的Tarlov評(píng)分與對(duì)照組相比,P值均<0.05(圖1)。正常大鼠BBB評(píng)分為滿分21分,損傷后第1天評(píng)分為0。訓(xùn)練2周、訓(xùn)練3周、訓(xùn)練4周組在訓(xùn)練結(jié)束時(shí)與對(duì)照組比較,BBB評(píng)分均顯著升高(P<0.05)。在訓(xùn)練結(jié)束后繼續(xù)觀察,評(píng)分與對(duì)照組相比,仍有顯著差異(P<0.05)(圖2)。2.2免疫組化檢測(cè)結(jié)果2.2.1運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組對(duì)髓內(nèi)bca表達(dá)的影響自然狀態(tài)下BDNF的表達(dá)在損傷后7~14天表現(xiàn)出較高水平,14~28天逐漸下降,35天表達(dá)又有增高(圖3、4)。在損傷后相同時(shí)間點(diǎn),運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠脊髓內(nèi)BDNF的表達(dá)較對(duì)照組(損傷非運(yùn)動(dòng)組)均明顯增加(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組在14天以后始終保持較高水平,訓(xùn)練停止后未見(jiàn)顯著降低,在訓(xùn)練2周觀察2周時(shí),BDNF的表達(dá)到各組最高值(圖3)。2.2.2同時(shí)間點(diǎn)的兩組大鼠一般情況比較運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠脊髓內(nèi)Slit2的表達(dá)與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組(非運(yùn)動(dòng)組)比較,也有明顯增加(P<0.01),以訓(xùn)練4周組表達(dá)最為顯著(圖5、6)。2.2.3下降：下降總體由“而非‘”下降與其他因子不同,GFAP在損傷后的表達(dá)為先升高后下降的趨勢(shì)。在對(duì)照組,損傷后14天GFAP表達(dá)達(dá)到最高,此后逐漸下降;而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練1周、2周組均表現(xiàn)出GFAP表達(dá)高峰延遲,在損傷后28天平均積分光密度A值達(dá)到(0.2029±0.0087),但與對(duì)照組高峰值(0.2011±0.0043)相比,P>0.05。訓(xùn)練3周、4周組因取樣時(shí)間點(diǎn)少,未顯示出趨勢(shì)變化(圖7)。3運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)髓內(nèi)神經(jīng)再生微的調(diào)控作用本研究中,以改良Tarlov評(píng)分法對(duì)SCI大鼠脊髓損傷程度作初步評(píng)估,以BBB評(píng)分從大鼠后肢關(guān)節(jié)活動(dòng)的數(shù)目和范圍、負(fù)重程度及前后肢協(xié)調(diào)性、前后爪和尾部活動(dòng)情況等多方面全面客觀反映大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能。以脊髓損傷后7天,運(yùn)動(dòng)功能開始自然恢復(fù)的上升期為起點(diǎn)進(jìn)行規(guī)律運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,結(jié)果顯示,訓(xùn)練2~4周后大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能均有顯著改善作用。且在訓(xùn)練停止后,后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分有延遲恢復(fù),提示恰當(dāng)?shù)挠?xùn)練能夠有效改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能。大鼠脊髓損傷后,大量神經(jīng)元丟失,廣泛軸突變性、伴隨嚴(yán)重功能喪失。相關(guān)功能的恢復(fù)有賴于通過(guò)損傷點(diǎn)的軸突的再生以及建立功能性突觸聯(lián)系。BDNF屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族,是促進(jìn)神經(jīng)再生的重要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一,對(duì)各種感覺(jué)神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、多巴胺神經(jīng)元以及GABA能神經(jīng)元的發(fā)育分化與生長(zhǎng)再生有維持和促進(jìn)作用,從多方面參與神經(jīng)再生。它被神經(jīng)末梢吸收,沿軸突逆行運(yùn)輸?shù)桨w,能提高神經(jīng)細(xì)胞軸突的再生能力,更好地提供神經(jīng)生長(zhǎng)的微環(huán)境。研究表明,BDNF在mRNA水平上調(diào)節(jié)了cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)和突觸蛋白Ⅰ的作用,而它們各自通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和突觸傳遞影響神經(jīng)功能的發(fā)揮。而且BDNF能同時(shí)增加自身和其受體的mRNA水平,提示運(yùn)動(dòng)可能以正反饋的形式擴(kuò)大了BDNF對(duì)突觸可塑性的影響。已有研究發(fā)現(xiàn),大鼠脊髓半切損傷后,損傷點(diǎn)的BDNF水平下降,但損傷后進(jìn)行自動(dòng)轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)能夠抵消這種降低,甚至使損傷處的BDNF水平高于正常,而且這種升高與運(yùn)動(dòng)長(zhǎng)度有很高相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組大鼠脊髓內(nèi)BDNF的表達(dá)較對(duì)照組(損傷非運(yùn)動(dòng)組)均明顯增加,提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)了脊髓內(nèi)BDNF的表達(dá)。最近有研究發(fā)現(xiàn),在脊髓損傷的大鼠,運(yùn)動(dòng)能使CREB和突觸蛋白Ⅰ的表達(dá)水平正?；?而BDNF阻斷劑削弱了這些與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的作用。這些均提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能通過(guò)增加BDNF的表達(dá),發(fā)揮其對(duì)突觸生長(zhǎng)的調(diào)控作用來(lái)改善神經(jīng)再生微環(huán)境。除增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)外,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練還可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)導(dǎo)向因子的表達(dá),發(fā)揮其對(duì)突觸生長(zhǎng)的調(diào)控作用來(lái)改善神經(jīng)再生微環(huán)境。Slits是一組膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,通過(guò)與其受體Robos結(jié)合發(fā)揮作用,是近年來(lái)研究較多的神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子。在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中,Slits及其受體Robo等調(diào)節(jié)軸突導(dǎo)向和神經(jīng)元遷移,對(duì)于決定發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)合纖維能否越過(guò)腹側(cè)中線,正確投射到靶位具有重要作用。此外,Slits還參與神經(jīng)元生長(zhǎng)和分枝形成,促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)纖維的分支和延伸。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后也有Slits的表達(dá),HaginoS等用原位雜交證實(shí),在液氮冷凍損傷的腦組織損傷點(diǎn)周圍有Slits的表達(dá);肖衛(wèi)東等發(fā)現(xiàn),SCI后受損脊髓局部存在Slit2的再次分泌,且在SCI后早期,損傷部位灰質(zhì)的膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)即可檢測(cè)到Slit2蛋白的表達(dá)。劉源等的研究表明,脊髓半橫斷損傷后3天,損傷位點(diǎn)近端前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Slit2mRNA的表達(dá)明顯增加。本研究中,不僅各實(shí)驗(yàn)組Slit2免疫組化平均積分光密度A值較相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組明顯升高,且隨訓(xùn)練時(shí)程或觀察時(shí)間延長(zhǎng),Slit2表達(dá)總體呈逐漸增高趨勢(shì)。從康復(fù)訓(xùn)練后神經(jīng)功能的恢復(fù)來(lái)看,作為引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)方向的重要因子Slit2可能參與了神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)過(guò)程,引導(dǎo)軸突建立特異的神經(jīng)通路,從而完成功能重建。脊髓損傷后早期星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大、增生,是一種保護(hù)性反應(yīng)。此時(shí),在損傷點(diǎn)周圍,BDNF免疫陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增生,可能分泌更多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。GFAP作為構(gòu)成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要蛋白,也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后膠質(zhì)反應(yīng)的主要標(biāo)志物。楊平林等報(bào)道,GFAP表達(dá)在脊髓損傷后5~7天達(dá)到高峰,損傷點(diǎn)及鄰近區(qū)域反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、增生。3~8周星形膠質(zhì)細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài),膠質(zhì)瘢痕形成。本研究中,對(duì)照組GFAP的表達(dá)在14天時(shí)達(dá)到最高(可能與取材部位在損傷點(diǎn)周圍有關(guān)),損傷14天后GFAP表達(dá)逐漸下降,至損傷后35天最低。盡管損傷后早期星型膠質(zhì)細(xì)胞能吞噬髓鞘碎片和退變的軸突,分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)引起,有利于神經(jīng)再生。但損傷后期,伴隨膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生,其所分泌的蛋白多糖和髓磷脂成分抑制軸突的延伸;局部空洞形成,增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的物理屏障,成為神經(jīng)纖維再生的極大障礙;微環(huán)境的各種不利因素最終導(dǎo)致軸突再生的失敗。在本實(shí)驗(yàn)中,各運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組GFAP的表達(dá)均顯示出高峰延遲,提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生程度減小,膠質(zhì)瘢痕形成減少,能顯著改善損傷后期神經(jīng)纖維再生的微環(huán)境。而訓(xùn)練2周組GFAP表達(dá)與訓(xùn)練1周、訓(xùn)練3周組比較明顯降低,可見(jiàn)選擇恰當(dāng)?shù)挠?xùn)練時(shí)程能夠使神經(jīng)再生環(huán)境達(dá)到最佳。本實(shí)驗(yàn)表明,脊髓損傷后大鼠在不同運(yùn)動(dòng)時(shí)程訓(xùn)練后,隨著軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)功能的改