登革病毒2型感染人靜脈血管內皮細胞株eahy926對細胞自噬的影響

登革病毒2型感染人靜脈血管內皮細胞株eahy926對細胞自噬的影響

病毒登格病毒（dv）是一種重要的害蟲病毒，通過堿性蚊子傳播。每年大約有100萬人感染該病毒，并嚴重威脅到亞熱帶和亞熱帶國家的公共衛(wèi)生安全。其中，登格病毒2型（dv2）最受歡迎。登革病毒可引起人類登革熱(denguefever,DF),嚴重者可出現登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。DHF/DSS最主要的特征為出血及血管滲漏,表明登革病毒在一定程度上會對血管內皮細胞造成損傷。因此DV誘導血管內皮損傷機制的研究一直是我們關注的焦點。自噬,是廣泛存在于真核細胞中的生命現象,是生物在其發(fā)育、老化過程中均存在的一種凈化自身多余或受損細胞器的共同機制,但過度的自噬可以導致細胞的程序性死亡,因此自噬又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。作為Ⅰ型程序性細胞死亡的凋亡與自噬之間復雜的動態(tài)關系尚未完全清楚,一般認為自噬作為細胞的保護機制,先于凋亡發(fā)生。我們前期研究表明,DV感染人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinsendotheliumcell,HUVEC)會誘導凋亡,在48h細胞凋亡達到高峰;DV也能誘導人臍靜脈內皮細胞株EAhy926發(fā)生凋亡,出現細胞凋亡高峰時間在60h。DV誘導的EAhy926細胞凋亡在達到高峰之前,細胞已發(fā)生了顯著的自噬,但發(fā)生自噬的機制及與凋亡之間的相互關系不明。為了解登革病毒誘導血管內皮細胞的自噬情況,本實驗利用流式細胞儀技術在DV2感染EAhy926細胞后不同時間點檢測發(fā)生自噬的細胞百分率與酸性自噬泡平均熒光密度,以此探討登革病毒感染對EAhy926自噬的影響,為進一步研究血管內皮細胞引起血管滲漏綜合癥及利用自噬抑制血管內皮細胞凋亡的可能性提供一定的理論參考依據。1材料和方法1.1材料表面1.1.1血管內皮細胞EAhy926是由人肺腺癌細胞株A549與原代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞HUVEC融合構建而成的永生化細胞株,具有血管內皮細胞的特性,為中山醫(yī)學院干細胞教研室惠贈。1.1.2病毒DV2病毒株來自中山醫(yī)學院微生物學教研室,本實驗室已進行病毒擴增和定量保存。1.1.3主試劑DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗等為Gibco產品。吖啶橙(acridineorange,AO)為Sigma產品。1.2方法1.2.1血清及青鏈霉素雙抗EAhy926用100mL/L胎牛血清及青鏈霉素雙抗為1.0×105U/L的DMEM/F12培養(yǎng)液,37℃,體積分數為5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。1.2.2胎牛血清中eayn986的表達對數生長期的EAhy926按1×106個/孔接種于6孔板,待細胞培養(yǎng)24h后,PBS洗滌2次。感染組的EAhy926取已定量好的2型登革病毒液(106pfu/mL)加入EAhy926細胞培養(yǎng)板中吸附2h,棄去上清,加入含20mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液,同時設立對照組(未吸附病毒,用含20mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)),37℃、體積分數為5%CO2培養(yǎng),于12、24、36、48h各時間點棄去培養(yǎng)液,收集細胞。1.2.3流式細胞術檢測細胞的制備同一批EAhy926細胞分成對照組和感染組,感染組在DV2感染EAhy926細胞后12、24、36、48h分別收集細胞,500×g5min離心,用PBS洗滌2遍。用buffer重懸并調整細胞數為1×106cells/mL吸取100μL轉移至5mL的流式離心管中,加入終濃度為0.5μg/mL的吖啶橙溶液混勻,室溫避光孵育10min,PBS洗滌2遍后用buffer200μL重懸,流式細胞儀檢測。對照組相應時間點收集細胞做同樣處理做以對照。實驗重復5次。1.3統(tǒng)計處理實驗數據用ue0af±s表示,運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和配對t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1感染組在不同時間點自噬細胞的細胞百分率對照組EAhy926細胞4個時間點(12、24、36、48h)發(fā)生自噬的細胞百分率分別為:(70±7)%,(72±6)%,(71±8)%和(69±10)%。感染組EAhy926細胞4個時間點自噬的細胞百分率分別為(75±3)%,(78±3)%,(77±5)%,(80±7)%(圖1),感染組自噬細胞百分率增加。實驗重復5次,對照組和感染組各時間點發(fā)生自噬的細胞百分率經方差分析和配對t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中48h對照組和感染組發(fā)生自噬的細胞百分率差異最明顯(圖2)。2.2酸性自噬泡熒光密度對照組4個時間點(12h,24h,36h,48h)酸性自噬泡平均熒光密度分別為:36.4±3.4,37.0±3.3,35.8±2.3,34.4±3.2。感染組酸性自噬泡平均熒光密度分別為41.1±2.3,45.0±4.8,41.3±3.3,44.5±7.5。感染組自噬泡平均熒光密度增加。實驗重復5次,對照組和感染組各時間點EAhy926酸性自噬泡平均熒光密度經方差分析和配對t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中在48h對照組和感染組酸性自噬泡平均熒光密度差異最明顯(圖3)。3紅色熒光的熒光檢測自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種細胞分解細胞質和/或細胞器等自身構成成分的生理現象,其發(fā)生是內因(損傷的細胞器、變異的蛋白的大量積蓄以及微生物感染等)與外因(細胞饑餓、低氧、激素刺激等)共同作用的結果。在細胞饑餓、生長因子缺乏和缺氧以及一些病理狀態(tài)下,自噬對維持細胞的存活有積極的作用,由于過度自噬可以導致細胞的程序性死亡,因此又被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。自噬的過程主要包括4個環(huán)節(jié):(1)底物誘導的自噬前體的形成;(2)自噬體形成;(3)自噬體與溶酶體融合;(4)自噬體內容物被降解。酸性自噬泡的產生是自噬的特異性過程。吖啶橙是一種熒光染料,其熒光波長會隨著細胞內pH值的變化而變化。在吖啶橙染色的細胞中,胞仁和胞漿分別發(fā)亮綠和暗紅色的熒光,而酸性細胞器發(fā)亮紅色的熒光。紅色熒光的強度與酸性細胞器的酸度和/或容積成正相關。因此,可以通過流式細胞儀利用FL1通道檢測綠色熒光,FL3通道檢測紅色熒光以觀察紅色熒光強度而判斷酸性自噬泡的形成情況,吖啶橙可以作為自噬的特征性標記物。鑒于自噬與凋亡的復雜關系,本文在前期研究的基礎上,繼續(xù)探討登革病毒對血管內皮細胞自噬的影響,以人靜脈血管內皮細胞株EAhy926細胞為細胞模型進行研究。實驗證明,登革病毒感染EAhy926后,在12h已出現顯著自噬,且長時間高水平維持,這可能是由于EAhy926是由人肺腺癌細胞株A549與原代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞HUVEC融合構建而成的永生化細胞株,EAhy926與A549有相似的細胞增殖能力,其細胞自噬水平與A549細胞相似。有報道1-3-芳基-1氫-吡唑-5-碳水化合物的衍生物能夠誘導A549發(fā)生自噬性死亡,而細胞凋亡及壞死均不明顯,內皮抑素可誘導EAhy926發(fā)生高水平的自噬,而只有15%~30%的細胞出現了凋亡,與我們的研究結果基本吻合。感染組各時間點EAhy926的發(fā)生自噬的細胞百分率較對照組有所升高,其中以48h最明顯,對照組發(fā)生自噬的細胞百分率為(69±10)%,感染組自噬細胞百分率為(80±7)%,P<0.05。相應地,感染組的EAhy926細胞酸性自噬泡的平均熒光密度較對照組有所升高,其中48h最明顯,對照組34.4±3.2,感染組為44.5±7.5,P<0.05。這可能是由于登革病毒作用于EAhy926細胞時,細胞發(fā)生的自噬可以將胞內物質降解和循環(huán)利用而使細胞得以繼續(xù)存活,高水平的自噬在惡劣環(huán)境中對其起到了一定的