甲殼動物精子發(fā)生與精子的生化

甲殼動物精子發(fā)生與精子的生化

本文在解釋甲殼動物精子的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，重點介紹了精子發(fā)生和精子生化的組成。1膜大型精細(xì)胞的發(fā)育甲殼動物的精子發(fā)生和形成過程都是在精巢內(nèi)產(chǎn)生和進(jìn)行的。精原細(xì)胞緊靠曲細(xì)精管的基膜,由基膜向管腔排列依次為不同發(fā)育時期的生精細(xì)胞:初級精母細(xì)胞,次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和分化中的精子。精原細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂成為初級精母細(xì)胞,初級精母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂染色體數(shù)目減半,分為兩個次級精母細(xì)胞,精子細(xì)胞經(jīng)過變態(tài)形成精子。但由于形成的精子形態(tài)各異,因此精子發(fā)生在許多細(xì)節(jié)上是不同的,特別是形成過程。1.1頭蝦亞綱(Cephalocarida)、須蝦亞綱(Mystacocaride)和鰓尾亞綱(Branchiura)精子發(fā)生的研究幾近空白。1.2對介形亞綱(Ostracoda)精子發(fā)生的報道均集中在腺狀介蟲科(Cypridae),且側(cè)重強(qiáng)調(diào)了螺旋狀結(jié)構(gòu)的形成。一般認(rèn)為其來源于核的外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基器,羽狀細(xì)胞器等。對于其它結(jié)構(gòu)的形成研究極少。1.3橈足亞綱(Cepepoda)的精子發(fā)生只有零星的報道,主要討論三方面。(1)中心粒:小型異猛水蚤(Heterolaophonteminuta)精子發(fā)生過程中中心粒始終存在,并固定位于核的后端與線粒體區(qū)之間,推測其不僅參與了精子的分裂,也在精子的形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮作用。(2)核膜:夏眠唇角水蚤(Labidoceraasestiva)核膜的崩解發(fā)生于精細(xì)胞進(jìn)入輸精管時,這些核膜碎片形成高度折疊的膜復(fù)合體,并位于成熟精子的質(zhì)膜邊緣。但在小型異猛水蚤未觀察到此現(xiàn)象。(3)頂體杯及片層的形成:在小型異猛水蚤頂體杯及嗜鋨片層的形成與核膜的消失無關(guān),而是由胞質(zhì)內(nèi)眾多小泡融合成的小池演變的,小池是起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基器有待確定。內(nèi)貽貝虱(Mytilicolaintestinalis)和萊氏鳋(Ergasiluslizae)頂端致密的片層起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小池,但其功能尚待研究。1.4蔓足亞綱(Cirripedia)精子發(fā)生的研究也較少。剛剛形成的早期精細(xì)胞有一橢圓形的核,單一的線粒體和具軸絲的中心粒區(qū),有些種類可見高爾基復(fù)合體。中期精細(xì)胞期頂體開始形成,精子形態(tài)變?yōu)闄E圓形。后期精細(xì)胞期附屬小滴形成,核沿著軸絲延伸,軸絲為9+2微管結(jié)構(gòu),除核及軸絲構(gòu)成鞭毛的主要成分外,還有糖元顆粒及一細(xì)長的線粒體。Kubo等(1979)認(rèn)為高爾基復(fù)合體在精細(xì)胞發(fā)育的不同時期發(fā)揮不同的作用,先后參與了頂體和附屬小滴的形成。但我們在研究中發(fā)現(xiàn),紋藤壺(Balanusamphitrite)精子發(fā)生過程中未見有典型的高爾基體,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與了附屬小滴的形成。1.5鰓足亞綱(Branchipoda)的精子發(fā)生目前研究的亦較少。無甲目鰓足蟲屬維氏鰓足蟲(Branchipusvisnyai)的精子發(fā)生中有一特殊的斑點狀(Nuage)結(jié)構(gòu)存在,精子沒有形成頂體和尾部,一簇簇致密黑色顆粒融合成一大的無定形顆粒;同時其線粒體的行為也相當(dāng)特殊,早期階段具有眾多細(xì)小的線粒體,最后發(fā)生融合形成了在成熟精子內(nèi)的巨大的多態(tài)線粒體,這種變化推測可能與減少線粒體外膜以利于其內(nèi)部基質(zhì)的運動有關(guān)。1.6在八個亞綱中軟甲亞綱(Malacostraca)精子發(fā)生的研究最多。1.6.1葉蝦目(Nebaliacea)是軟甲亞綱最原始的類群。Jespersen(1979)曾研究了葉蝦屬(Nebalia)兩個種類的精子發(fā)生,并認(rèn)為它們的形成過程基本相同。早期精細(xì)胞聚集成群,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有多個核,胞膜邊緣分布著致密的凸起物。中期精細(xì)胞分散,但通過營養(yǎng)細(xì)胞相連,營養(yǎng)細(xì)胞之分泌液將精細(xì)胞包繞形成精莢,精子在精莢內(nèi)成熟,成熟過程中細(xì)胞變?yōu)橹旅?細(xì)胞質(zhì)空泡化,線粒體退化,中心粒消失,細(xì)胞表面不規(guī)則,凸起物發(fā)育成棘,但在精莢內(nèi)無極性。在整個發(fā)育過程中都沒有形成頂體和鞭毛。1.6.2山蝦目(Anaspidacea)也是軟甲亞綱十分原始的類群。塔斯馬利亞山蝦(Anaspidestasmaniae)精子卵圓形,前端覆蓋頂體,葉狀的核和線粒體占據(jù)整個細(xì)胞,長形亞頂體纖維貫穿核并形成螺旋體以支持細(xì)胞質(zhì)后端的延伸物。在整個發(fā)育過程中沒有形成鞭毛,精子不運動,包埋于由輸精管分泌的小囊內(nèi)。1.6.3在囊蝦總目(Peracarida)糠蝦目(Mysidacea)無刺大糖蝦(Praunusinermis)和漣蟲目(Cumacea)三刺長漣蟲(Iphinoetrispinosa)的精子發(fā)生過程中,次級精母細(xì)胞的核外,總有一些位于核孔區(qū)與核膜并行的致密不透明物質(zhì),稱之為擬染色體,其周圍包繞著眾多的線粒體。在早期精細(xì)胞,?？梢娺@些擬染色體及線粒體緊靠高爾基復(fù)合體。但到了后期只有高爾基復(fù)合體與擬染色體相連,線粒體缺失,并出現(xiàn)高爾基合體膜的溶解,高爾基小泡內(nèi)的物質(zhì)與擬染色體的物質(zhì)相混合。在精細(xì)胞的最終成熟過程中,這些擬染色體濃縮、伸長,并最終成為桿狀的亞頂體區(qū)。精子發(fā)生過程中線粒體與擬染色體的關(guān)系可能是擬染色體可提供線粒體合成ATP所需的物質(zhì),而高爾基復(fù)合體則部分參與了亞頂體區(qū)的形成。在等足目(Isopoda)壁潮蟲(Oniscusasellus)和盔甲櫛水虱(Asellusmilitaris)及端足目(Amphipoda)跳鉤蝦屬(Orchestoideasp.),亞頂體的桿狀結(jié)構(gòu)最初被認(rèn)為起源于早期精細(xì)胞之胞質(zhì)中的電子致密體。從Reger(1977)的研究可知這一致密體即是擬染色體。因此等足目和端足目的桿狀亞頂體區(qū)也是起源于擬染色體。說明了囊蝦總目精子發(fā)生的相似性,從而產(chǎn)生了形態(tài)相似的精子。在真蝦總目(Eucarida)十足目(Decapoda)爬行亞目(Reptantia)中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的精子發(fā)生過程中,擬染色體在精原細(xì)胞中出現(xiàn),在初級精母細(xì)胞中包圍中心粒,形成中心粒附屬物,隨后消失不見,說明了與囊蝦總目擬染色體在功能上存在極大的差異。是否與導(dǎo)致不同形態(tài)的精子有關(guān)值得探討。1.6.4比較十足目的精子發(fā)生[1,9～12],早期精細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)和一般形態(tài)上是相似的。其主要特征是核和一大的前頂體腔。它們各占據(jù)細(xì)胞的兩極。但在游泳亞目(Natantia)對蝦部(Penaeidea)細(xì)胞質(zhì)圍繞著核分布,爬行亞目的細(xì)胞質(zhì)則位于前頂體腔下面與核相鄰的區(qū)域,即與核共占據(jù)細(xì)胞另一極的兩側(cè)。我們對長毛對蝦(Penaeuspenicillates)和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)的研究也證實了這一結(jié)論。但在游泳亞目真蝦部(Caridea),精子在發(fā)生過程中沒有形成前頂體腔。核:游泳亞目染色質(zhì)在精子發(fā)生過程中經(jīng)歷了多次形態(tài)變化。在早期精細(xì)胞內(nèi)它形成了多個大塊的異染色質(zhì)區(qū),之后成為非濃縮狀的均勻核質(zhì),最后在成熟精子中成為所有十足目精子均相似的疏松而非致密的結(jié)構(gòu)。對蝦部最初連續(xù)的核膜在中期精細(xì)胞崩解,使核質(zhì)可自由交換。這兩個特征也是許多爬行亞目種類的共同特征,但在閃光龍蝦(Panulirusargus)和斑點龍蝦(P.guttatus)的成熟精子中有一連續(xù)的核膜。與大多數(shù)十足目不同的是,真蝦部在整個精子發(fā)生過程中保留完整的核膜。對蝦科(Penaeidae)短額蝦亞科(Eusicyoninae)銳脊單肢蝦(Sicyoniaingentis)外核膜可能直接參與了前頂體腔的形成;在片刺褐蝦(Crangonseptemspinosa)精子中,部分外核膜伸入精子的頂體區(qū),Demestre等(1993)也在對蝦部的觸須蝦(Aristeusantennatus)報道了類似的現(xiàn)象,但在長額擬對蝦(Parapenaeuslongirostris)的精子發(fā)生過程中卻未觀察到核膜的這一變化。因此,核膜參與前頂體腔的形成之說并不適用于所有的十足目動物。細(xì)胞質(zhì):游泳亞目的早期精細(xì)胞具有圍繞核區(qū)的細(xì)胞質(zhì)帶,但在爬行亞目中細(xì)胞質(zhì)位于頂體腔和核之間。這兩種類型的存在可能與頂體的相對位置是相統(tǒng)一的。前者將形成具有棘突的精子,后者則發(fā)育成無棘突的精子。目前研究過的十足目種類的精子發(fā)生均證實了這一點。在十足目的許多種類,早期精細(xì)胞的胞質(zhì)囊泡化,一些囊泡融合成大的前頂體腔。胞質(zhì)內(nèi)緊靠核和發(fā)育中的頂體的膜復(fù)合體在十足目的精子中普遍存在。在短尾派(Brachyra)退化的膜復(fù)合體融合并進(jìn)入穿孔器。同樣,在長額擬對蝦這些退化的膜復(fù)合體延伸至亞頂體區(qū)。關(guān)于腹復(fù)合體的起源有些學(xué)者認(rèn)為可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合卷曲而成。當(dāng)精細(xì)胞體積減小后,周邊細(xì)胞質(zhì)形成一圍繞核區(qū)的薄帶,薄帶內(nèi)具有退化的線粒體和殘余的膜聚集。中心粒命運在不同種類也不盡相同,一些種類在早期精子發(fā)生過程中隨著中心粒的退化,在成熟的精子內(nèi)不再出現(xiàn)。如長額擬對蝦,且微管在這一種類的精子發(fā)生過程中均未觀察到。中心粒在對蝦部的成熟精子內(nèi)一般不存在,盡管在真蝦部的精子中單或雙個中心粒普遍存在。中心粒在爬行亞目的精子中存在與否因種而異。前頂體腔及頂體:十足目早期精細(xì)胞的顯著特征是具有一大的前頂體腔。早期的研究認(rèn)為其起源于高爾基體,有的認(rèn)為起源于線粒體。近年來,通過電鏡研究表明某些種類在形成前頂體腔的囊泡周圍聚集著許多以同心圓排列的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),如本實驗室研究的長毛對蝦;有些種類則聚集著許多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡,因此可以推測前頂腔起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在長額擬對蝦前頂體腔絮狀的基質(zhì)內(nèi)有一高電子密度的濃縮體,大量的細(xì)胞質(zhì)可能參與了這一結(jié)構(gòu)的形成。銳脊單肢蝦前頂體腔內(nèi)的頂體物可能是由幾種內(nèi)含致密橢圓體的膜囊相互融合聚集成的致密濃縮體。這些致密體的超微結(jié)構(gòu)在上述這兩種蝦的頂體形成早期是十分相似的,但進(jìn)一步的分化就出現(xiàn)了差異。第一種情況是致密體與頂體腔前膜接觸并形成棘突原基,最后分化成的頂體結(jié)構(gòu)較為簡單。而第二種情況則是致密體與頂體腔后膜接觸,其中的棘突原基與其它致密體分開,最終產(chǎn)生較為復(fù)雜的頂體結(jié)構(gòu)。這兩種情況可能分別代表了它們各自科的特點。本實驗室的研究表明,長毛對蝦的頂體形成過程類似于第一種情況,前頂體腔的致密體均一,但致密體似乎先與頂體腔的后膜接觸,然后向前延伸形成棘突,頂體腔的其它部分分化為內(nèi)外頂體層,因此,長毛對蝦的頂體結(jié)構(gòu)較銳脊單肢蝦簡單。由此可見,對蝦亞科(Penaeinae)和短額蝦亞科之間最主要的區(qū)別就在于頂體的形成和結(jié)構(gòu)。爬行亞目短尾派唐氏招潮蟹前頂體腔內(nèi)致密體的形成及其之后的分化與銳脊單肢蝦相似。其它一些種類雖未詳盡地闡述其分化過程,也未比較和游泳亞目的區(qū)別,但從他們的觀察中均認(rèn)為隨著精子的分化和成熟,前頂體再分化出頭帽,片層結(jié)構(gòu)、中間層和絲狀層,同時,前頂體腔近核一端的中央內(nèi)凹,由膜復(fù)合體產(chǎn)生電子密度低的物質(zhì),一部分進(jìn)入凹陷形成中央管,另一部分在頂體囊外周形成頂體管的外周延伸部分,從而形成結(jié)構(gòu)完整的頂體。與其它十足目相比較,真蝦部精子顯著的特征是棘突結(jié)構(gòu)沒有膜界,它是從與核膜膜相連的大量的膜結(jié)構(gòu)起源的物質(zhì)形成的,呈PAS陰性,且在受精過程中未發(fā)生頂體反應(yīng)。因此,真蝦部和對蝦部精子的棘突在結(jié)構(gòu)、形成和功能上顯然是不同的,提示了真蝦部在精子的分化和功能上有一相對獨立的進(jìn)化路徑。2生物化學(xué)2.1精子內(nèi)不含堿性蛋白通常,細(xì)胞核中酸性的DNA與組蛋白等堿性蛋白和非堿性蛋白相結(jié)合以維持穩(wěn)定。在大多數(shù)后生動物的精子發(fā)生過程中,組蛋白要被堿性更強(qiáng)的堿性蛋白如:魚精蛋白所取代,從而產(chǎn)生染色質(zhì)高度濃縮,體積小而致密的細(xì)胞核。甲殼動物既有有鞭毛的運動型精子,也有無鞭毛的非運動型精子,這兩類精子核內(nèi)含物成分有很大區(qū)別,是甲殼動物精子細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)各異的物質(zhì)基礎(chǔ)。曾發(fā)現(xiàn)可很方便、很完全地把蟹和寄居蟹精子中的DNA絲與蛋白質(zhì)分離開,染色質(zhì)絲的直徑平均為20AA。染色質(zhì)絲是由含相當(dāng)特殊的堿基位點的DNA所構(gòu)成。在普通黃道蟹(Cancerpagurus)衛(wèi)星DNA的“多聚dAT”占有很大比例,這些可能與無鞭毛非運動型精子核內(nèi)不含堿性蛋白有關(guān)。Sellos等(1981)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了鋸齒長臂蝦(Palaemonserratus)精巢和精子的生化組成,特別是組蛋白的特性。鋸齒長臂蝦精子不含魚精蛋白。但有具有體細(xì)胞特征的組蛋白和H1的配體。這些蛋白經(jīng)Biogelp-100純化后,氨基酸組成與H2A,H2B組蛋白相似,分子量約為155000。染色質(zhì)的生化分析表明,堿性蛋白/DNA高達(dá)0.94,與體細(xì)胞的比例相近。我們的研究結(jié)果表明,屬無鞭毛、非運動型的成熟蝦蟹精子核內(nèi)均不含堿性蛋白[15～17],與此相一致的是這些精子的細(xì)胞核呈疏松狀。近來,我們進(jìn)一步用電鏡細(xì)胞化學(xué)的手段研究了刀額新對蝦精子堿性蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)在頂體形成的同時,核內(nèi)堿性蛋白被拋棄。最近,Chiva(1992)在甲殼動物蔓足亞綱這類有鞭毛的精子云狀藤壺(Balanusnubilus)中首次發(fā)現(xiàn)了魚精蛋白,這一蛋白內(nèi)含有相當(dāng)豐富的賴氨酸,其次是精氨酸,兩者占67.7mol%,絲氨酸占10.9mol%。據(jù)Subirana(1983)的標(biāo)準(zhǔn),Lys+Arg=45～80mol%,Ser+Thr=10～25mol%的可稱為B4。因此,可將云狀藤壺的魚精蛋白歸為B4。Chiva同時還檢測到這一魚精蛋白與核內(nèi)的三種酸性蛋白相并存,這些蛋白與Vaugh和Hinsch(1972)先前所描述的獨特的蛋白在成分上是相關(guān)的。他認(rèn)為甲殼動物精子酸性蛋白的存在可為研究DNA-酸性蛋白-魚精蛋白的相互作用關(guān)系建立一個有趣的模式。2.2頂體的結(jié)構(gòu)性研究甲殼動物頂體的起源一直是研究的熱點。它總是PAS陽性,包含糖類和蛋白質(zhì)。在十足目,已對其頂體中堿性蛋白的濃集及核內(nèi)組蛋白的喪失進(jìn)行了研究。新對蝦精子頂體形成過程中,在原頂體囊出現(xiàn)時就有了堿性蛋白。頂體內(nèi)堿性蛋白的豐富度隨十足目種類的不同有所差異。且在成熟精子內(nèi)的分布也有些不同。Chevaillier(1970)比較了幾種蟹的堿性蛋白的分布,挪威龍蝦(長尾派)堿性蛋白僅位于穿孔器的中央管壁的邊緣。寄居蟹(異尾派)擴(kuò)展到整個囊狀腔內(nèi),真蟹(短尾派)則位于中央管壁及頭帽附近。我們研究發(fā)現(xiàn),鋸緣青蟹(短尾派)似乎與真蟹也不同,堿性蛋白位于除中央管外的整個頂體腔。我們在對蝦的研究中也發(fā)現(xiàn)刀額新對蝦精子堿性蛋僅位于內(nèi)外頂體層,而長毛對蝦的棘突中也有堿性蛋白分布。在挪威龍蝦和蟹的頂體顆粒中堿性蛋白是游離的且富含精氨酸,相似埃默蟹(Emeritaanaloga)的頂體腔內(nèi)則是富含賴氨酸的堿性蛋白。Chevailier(1970)稱這些蛋白質(zhì)為“十足目蛋白(dccapodine)”,且其分布及氨基酸組成隨種類而異。Vaughn(1968)和Chevaillier(1970)認(rèn)為核一胞質(zhì)交換對頂體腔內(nèi)含物的形成是相當(dāng)重要的,但我們在刀額新對蝦的研究中未觀察到核內(nèi)堿性蛋白轉(zhuǎn)移至頂體的過程。最近,Tsai和Talbot(1994)對美洲龍蝦(Homarusamericanus)頂體腔的收縮成分進(jìn)行了細(xì)致的研究。美洲龍蝦的頂體可分為四區(qū)。采用梯度離心分離出頂體杯,SDS顯示,頂體杯有8條主要的多肽帶,分子量從37×103到66×103μ,另有5條附加帶,分子量為18×103～29.5×103μ。頂體的3區(qū)僅含有40×103μ的蛋白,用RLA60標(biāo)記顯示,其功能可能是促進(jìn)精子和卵黃膜的接觸。29×103μ的蛋白在頂體反應(yīng)中完全釋放出來,反應(yīng)了的精子沒有4區(qū),推測它是頂體4區(qū)的成分。其它10條帶可部分被釋放,其中7條帶可能是頂體腔的成分,另3條是內(nèi)外頂體層的物質(zhì)。這一收縮成分不屬于肌動蛋白-肌漿球蛋白體系,而是細(xì)胞外收縮的功能蛋白。2.3actin的存在和分類目前,隨著免疫熒光技術(shù)的應(yīng)用,甲殼動物特別是十足目精子的細(xì)胞骨架研究取得了重大的進(jìn)展。Tudge(1994a)用單克隆抗肌動蛋白抗體和三種不同的單克隆抗管蛋白抗體的間接免疫熒光技術(shù)研究了紅細(xì)螯寄居蟹(Clibanariuseiythropus),蜘蛛蟹(Majasquinado),普通黃道蟹和溪蟹(Potamonfluviatile)的細(xì)胞骨架蛋白、肌動蛋白(actin)和管蛋白(tubalin)的存在和分布情況。Actin存在于四種蟹中,但Actin的熒光類型不同,蜘蛛蟹和普通黃道蟹的頂體腔內(nèi)有致密的熒光,是參與頂體反應(yīng)的成分;溪蟹的頂體內(nèi)也有Actin,而在紅細(xì)螯寄居蟹,Actin則存在于細(xì)胞質(zhì)中。四種蟹中均未見F-actin。Tubulin僅出現(xiàn)在前三種蟹的細(xì)胞質(zhì)中,溪蟹未見。在此基礎(chǔ)上Tudge(1994b)采用單克隆和多克隆抗肌動蛋白抗體的免疫熒光,熒光鬼筆環(huán)肽和DNA酶對普通黃道蟹進(jìn)行了更深入的研究。Actin位于頂體腔內(nèi)兩個明顯的