不同移植時(shí)間窗對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的影響

不同移植時(shí)間窗對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的影響

近年來，隨著神經(jīng)生物學(xué)和干燥科學(xué)的發(fā)展，骨髓間質(zhì)干燥物（msec）的移植和脊柱損傷（slac）的治療取得了很大進(jìn)展。許多研究結(jié)果表明,MSCs移植治療SCI能明顯改善損傷脊髓的神經(jīng)功能,治療作用與MSCs具有替代壞死神經(jīng)元、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子橋接作用和誘導(dǎo)等有關(guān)。然而如何把握MSCs移植的合適時(shí)間,目前的研究資料尚無肯定的答案。另外,不同移植時(shí)間窗對MSCs的生存、遷移及神經(jīng)功能恢復(fù)影響的研究少見報(bào)道。為探討MSCs移植的最佳時(shí)間,本研究觀察了不同移植時(shí)間窗對經(jīng)靜脈移植的MSCs在大鼠損傷脊髓內(nèi)存活和遷移及其對移植后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。1材料和方法1.1idase活性變化選用清潔級健康雄性SD大鼠90只,2～3月齡,體質(zhì)量150～250g,由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其中10只用于細(xì)胞培養(yǎng)取材;40只用于觀察脊髓組織學(xué)和髓過氧化物酶(myoleperoxidase,MPO)活性變化,分8組:假手術(shù)組、SCI后0、6、12、24h,3、5和7d組,每組5只;40只用于觀察不同時(shí)間窗經(jīng)靜脈移植的MSCs在損傷脊髓內(nèi)的生存數(shù)和遷移距離,分8組:假手術(shù)組、SCI后0、6、12、24h,3、5和7d移植組,每組5只。主要試劑:αMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國HyClone公司);胰蛋白酶(Trypsin1:250,Amersco);Ficoll-Paque分離液(美國Pharmacia公司);MPO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);核熒光染料Hoechst33342(美國PharMingen公司)。1.2良浚法良浚法按照文獻(xiàn)報(bào)告,暴露胸10段脊髓,采用改良Allen法,致傷量為50g×cm,造成胸10段脊髓的沖擊傷。假手術(shù)組大鼠同法暴露胸10段脊髓,不造成脊髓沖擊傷。1.3cd45、cd29、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd49、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd45、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29、cd29按常規(guī)方法體外分離、培養(yǎng)MSCs,并傳代,流式細(xì)胞儀檢測第2代MSCs的CD34、CD45、CD29、CD90表達(dá)。收集第3代培養(yǎng)7～8d的MSCs懸液,用核熒光標(biāo)記液Hoechst33342(10mg/L,αMEM/F12培養(yǎng)液配制)孵育2h,經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后制備濃度為1×106/ml的MSCs懸液,4℃下儲存?zhèn)溆谩?.4mscs細(xì)胞懸液的制備假手術(shù)組在手術(shù)后12h,移植組在動(dòng)物模型建立后0、6、12、24h,3、5和7d,經(jīng)尾靜脈注射Hoechst33342標(biāo)記的第3代MSCs單細(xì)胞懸液1ml。術(shù)畢放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。1.5損傷區(qū)頭端髓組織的測定假手術(shù)組大鼠在手術(shù)后24h,損傷組于SCI后0、6、12、24h,3、5和7d7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)再次麻醉后迅速開胸,以4%多聚甲醛500ml經(jīng)左心耳灌注固定,完整地切取損傷脊髓胸10～12節(jié)段。取損傷區(qū)頭端脊髓組織約50mg,立即存放-70℃,待行MPO活性測定。取損傷區(qū)尾端脊髓組織浸入10%中性甲醛固定24h,常規(guī)乙醇脫水,石蠟包埋,以片厚5μm連續(xù)切片,H-E染色,在顯微鏡下觀察損傷區(qū)脊髓病理組織學(xué)改變情況。1.6大鼠骨髓組織勻漿的制備取存放-70℃的大鼠損傷脊髓組織和假手術(shù)組相同部位大鼠脊髓組織,電子天平稱重,按重量體積比為1∶19加勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿。取組織勻漿進(jìn)行MPO活性測定,具體操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。1.7運(yùn)動(dòng)功能觀察和運(yùn)動(dòng)能力分析各組大鼠分別于移植前和移植后7d放在75cm×125cm的開放空間,采用BBB后肢運(yùn)動(dòng)功能評分標(biāo)準(zhǔn),3人、雙盲法獨(dú)立觀察大鼠雙后肢的運(yùn)動(dòng)功能并記錄。1.8骨髓縱向的熒光顯微觀察移植組大鼠在MSCs細(xì)胞移植后7d再次麻醉后迅速開胸,以4%多聚甲醛500ml經(jīng)左心室灌注固定,完整地切取損傷脊髓胸10～12節(jié)段。用4%多聚甲醛后固定4h,再置于30%蔗糖溶液中浸泡至組織下沉到瓶底。用恒冷箱冷凍切片機(jī)做脊髓胸10～12節(jié)段連續(xù)縱切片,厚20μm。每組脊髓縱切片每隔5片取1片在熒光顯微鏡下(10×20)用410nm激發(fā)波長進(jìn)行移植的存活細(xì)胞計(jì)數(shù)。用方格測試系統(tǒng)在每張縱切片的脊髓損傷區(qū)頭端和尾端組織各取4個(gè)單位面積(0.16mm2),計(jì)數(shù)這些單位面積內(nèi)所發(fā)出藍(lán)色核熒光的細(xì)胞總數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí),以發(fā)出藍(lán)色熒光、呈橢圓形或圓形、大小較均一的細(xì)胞核作為存活MSCs的細(xì)胞核。1.9移植細(xì)胞遷移距離每組脊髓縱切片每隔5片取1片在熒光顯微鏡下(10×20)用410nm激發(fā)波長進(jìn)行移植細(xì)胞遷移距離的測量。應(yīng)用熒光顯微鏡本身載物臺標(biāo)本移動(dòng)距離測量尺測量移植細(xì)胞從脊髓損傷區(qū)邊緣遷移到頭端或尾端組織最遠(yuǎn)處之間的距離。1.10均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差記錄采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,各項(xiàng)檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x?±s)(x-±s)記錄。兩組間采用t檢驗(yàn),多組間采用單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,當(dāng)P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1mscs的體外擴(kuò)增培養(yǎng)的MSCs24h后逐漸出現(xiàn)貼壁,其他血細(xì)胞通過換液逐漸除去,此時(shí)貼壁細(xì)胞呈巨單核細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)不一,可有梭形、多角形或星芒狀突起,為單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的克隆,細(xì)胞增殖迅速。12～14d,90%以上細(xì)胞融合,融合細(xì)胞都呈梭形,原代可獲得1×106～2×106個(gè)MSCs。傳代的細(xì)胞于24h內(nèi)完全貼壁,形態(tài)多呈梭形,10～12d融合,體外擴(kuò)增5代細(xì)胞數(shù)約為1×1011個(gè)。流式細(xì)胞儀檢測10份第2代細(xì)胞樣本,結(jié)果顯示:CD34、CD45表達(dá)陰性,CD29、CD90表達(dá)陽性(圖1)。2.2髓組織病理學(xué)結(jié)果假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)正常,整個(gè)組織結(jié)構(gòu)完整清晰,未見腫脹改變,核圓,可見核仁。SCI后0h,脊髓組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常;SCI后6和12h,脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)見少量點(diǎn)片狀出血,同時(shí)部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹,核偏移,核仁尚清;SCI后24h,脊髓白質(zhì)內(nèi)可見大片出血病灶,脊髓組織實(shí)質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞明顯水腫,部分神經(jīng)元固縮、變小,核萎縮,結(jié)構(gòu)不清(圖2A);SCI后3d,脊髓組織結(jié)構(gòu)疏松,神經(jīng)元大量壞死;SCI后5和7d,脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元稀少,實(shí)質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞增生形成瘢痕(圖3)。2.3兩組mpo活性表達(dá)比較大鼠SCI后不同時(shí)間脊髓組織MPO活性和假手術(shù)組大鼠脊髓MPO活性表達(dá):假手術(shù)組和SCI后0h組MPO活性表達(dá)弱,分別為(4.39±0.48)nkat/g和(5.16±0.51)nkat/g;SCI后6h出現(xiàn)MPO活性表達(dá)增強(qiáng)(27.46±3.17)nkat/g,24h到達(dá)高峰(58.18±5.49)nkat/g,3d后開始下降(40.56±4.59)nkat/g,7d后回到假手術(shù)組水平(4.64±0.41)nkat/g(圖4)。與假手術(shù)組比較,SCI后6h、12h、24h、3d和5d各組的MPO活性表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),SCI后0h和7d2組的MPO活性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與SCI后24h組比較,其他各組的MPO活性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。2.4移植前各組大鼠的bcb評分差異每組大鼠移植前和移植后雙后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評分分?jǐn)?shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),移植后大鼠BBB評分分?jǐn)?shù)明顯高于移植前,說明移植MSCs能明顯改善大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能(圖5);移植后各組之間大鼠BBB評分分?jǐn)?shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SCI后3d移植組BBB評分分?jǐn)?shù)明顯高于其他6組(P<0.01),SCI后0、6、12和24h移植4組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),SCI后5和7d移植2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此SCI后3d移植MSCs,大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)最好。2.5d移植組與鄰近組織治療髓傷超氧時(shí)期血壓ld在熒光顯微鏡下,可觀察到各組的脊髓損傷處及其鄰近組織有許多被Hoechst33342標(biāo)記的移植細(xì)胞,移植的MSCs多數(shù)集中分布于脊髓損傷處,有部分遷移到鄰近組織。每組大鼠脊髓損傷處頭、尾端存活數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);SCI后3d移植組大鼠脊髓損傷處頭端、脊髓損傷處尾端存活數(shù)和存活總數(shù)明顯高于其他6組(P<0.01)(圖6～8);SCI后0、6、12、24h,5和7d移植組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此SCI后3d移植MSCs,大鼠脊髓內(nèi)移植的MSCs存活數(shù)最多(表1)。2.6髓內(nèi)移植mscs的預(yù)測結(jié)果每組大鼠脊髓內(nèi)移植的MSCs向頭端和尾端組織遷移距離無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);SCI后0、6、12、24h和3d移植5組與SCI后5和7d移植2組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),前5組脊髓內(nèi)移植的MSCs向頭端組織或尾端組織遷移距離明顯大于后2組,SCI后0、6、12、24h和3d移植5組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),SCI后5和7d移植2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。這提示SCI后5和7d移植的MSCs在損傷脊髓內(nèi)遷移的能力明顯下降。3討論3.1髓組織mpo活性檢測免疫炎癥反應(yīng)是SCI后的一種病理生理過程,在繼發(fā)性脊髓損傷過程中發(fā)揮重要作用。中性粒細(xì)胞是急性炎癥反應(yīng)的主要炎癥細(xì)胞,MPO是一種特異性酶,與中性粒細(xì)胞的絕對數(shù)量相關(guān)聯(lián),是一個(gè)定量中性粒細(xì)胞對損傷組織浸潤的特異和敏感標(biāo)記。因此通過MPO活性測定可用來定量分析脊髓組織炎癥反應(yīng)情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在SCI后3d內(nèi),脊髓組織MPO活性明顯增強(qiáng),組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,表明免疫炎癥反應(yīng)在脊髓繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示,在大鼠SCI后3d,脊髓組織MPO活性表達(dá)減弱,說明SCI后3d,脊髓免疫炎癥反應(yīng)開始減輕。在大鼠SCI后5d和7d,脊髓組織MPO活性表達(dá)恢復(fù)到假手術(shù)組水平,但損傷區(qū)有膠質(zhì)細(xì)胞增生,說明SCI后5d,由于免疫炎癥反應(yīng),誘發(fā)了脊髓組織形成瘢痕。3.2mscs在不同組織區(qū)的遷移距離本實(shí)驗(yàn)觀察到,各組大鼠SCI后經(jīng)尾靜脈注射MSCs,在脊髓損傷區(qū)及其鄰近組織可檢測到存活的MSCs,表明MSCs經(jīng)靜脈移植能透過血腦屏障,到達(dá)損傷區(qū)及其鄰近組織。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在SCI后0、6、12和24h不同時(shí)間窗經(jīng)靜脈移植的MSCs存活數(shù)量明顯較少,說明SCI后的嚴(yán)重免疫炎癥反應(yīng)對移植的MSCs產(chǎn)生毒性作用,不利于MSCs的存活。但另一方面,在免疫炎癥反應(yīng)過程中,多種炎癥因子、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子對移植的MSCs具有趨化作用,導(dǎo)致MSCs向損傷區(qū)及其鄰近組織遷移,本實(shí)驗(yàn)觀察到,在SCI后0、6、12、24h和3d不同時(shí)間窗移植的MSCs在脊髓組織內(nèi)遷移的距離明顯較長。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示,在SCI后5d和7d2個(gè)時(shí)間窗經(jīng)靜脈移植的MSCs存活數(shù)量較少,在脊髓組織內(nèi)遷移的距離較短,推測這種現(xiàn)象與下列因素有關(guān),SCI后5和7d,破壞的血腦屏障結(jié)構(gòu)開始重建,透過血腦屏障的MSCs數(shù)量減少;SCI后5和7d,免疫炎癥反應(yīng)減弱,炎癥細(xì)胞減少,多種炎癥因子表達(dá)下調(diào),對移植MSCs的趨化作用減弱;損傷區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的瘢痕不利于移植MSCs的遷移。3.3動(dòng)物源細(xì)胞毒性變化BBB評分法是評價(jià)脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)過程的的主要方法之一,本實(shí)驗(yàn)BBB評分結(jié)果顯示,各組大鼠移植前和移植后雙后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評分分?jǐn)?shù)有顯著性差異,