wke大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠血管緊張素

wke大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠血管緊張素

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（ras）一直是高血壓病因研究的中心問(wèn)題。研究表明,腦內(nèi)存在獨(dú)立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotensinsystem,RAS),尤以丘腦下部、腦干及邊緣系統(tǒng)含量最高。在腦內(nèi)血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)可與下丘腦、延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostralventrolateralmedulla,RVLM)等部位的血管緊張素Ⅱ1型受體(AT-1R)結(jié)合,進(jìn)而通過(guò)興奮交感神經(jīng)或刺激下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PVN)、視上核(supraopticnucleus,SON)生成血管加壓素(argininevasopressin,AVP)增多引起升壓效應(yīng)。下丘腦PVN具有神經(jīng)內(nèi)分泌功能,參與植物神經(jīng)活動(dòng)的控制,對(duì)高血壓的發(fā)生發(fā)展也可能有影響。下丘腦含有合成血管緊張素原的神經(jīng)元,可生成AngⅡ,AngⅡ與AT-1R結(jié)合發(fā)揮其腦內(nèi)的作用。此外,下丘腦的PVN還發(fā)出纖維投射到RVLM、臂旁核和脊髓中間外側(cè)核等部位。大量的實(shí)驗(yàn)證明RVLM是調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)、維持血壓的關(guān)鍵腦區(qū)。RVLM是交感縮血管神經(jīng)元所在的部位,刺激RVLM可增強(qiáng)交感傳出和升高血壓;在RVLM存在的多種遞質(zhì)對(duì)心血管活動(dòng)起重要調(diào)節(jié)作用,如乙酰膽堿、去甲腎上腺素、氨基酸、血管緊張素等。RVLM將來(lái)自其他中樞和外周傳入信息整合后傳到脊髓中間外側(cè)柱交感節(jié)前神經(jīng)元處,最終完成對(duì)心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)。自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,SHR)是目前研究EH最常用的動(dòng)物模型,本實(shí)驗(yàn)選擇16周齡SHR,此周齡大鼠處于高血壓穩(wěn)定期以后的靶器官并發(fā)征期。運(yùn)用免疫熒光染色分析WKY和SHR大鼠下丘腦及RVLM內(nèi)AT-1R陽(yáng)性神經(jīng)元的分布。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心16周齡健康WKY和SHR大鼠(中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體質(zhì)量280~300g,雌雄不拘,自然晝夜節(jié)律光照,自由攝食和飲水。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1abp數(shù)據(jù)分析大鼠經(jīng)10%水合氯醛(2.5mL/kg)腹腔注射麻醉后,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并插入充有肝素生理鹽水溶液的PE50聚乙烯管,經(jīng)壓力傳感器與四通橋式放大器(QUADbridge,ADInstruments,Australia)相連,經(jīng)PowerLab數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)(8SP,ADInstruments,Australia)記錄動(dòng)脈血壓(arterialbloodpressure,ABP),并應(yīng)用PowerLab軟件對(duì)ABP信號(hào)進(jìn)行處理,實(shí)時(shí)同步記錄平均動(dòng)脈壓(meanarterialpressure,MAP)和心率(heartrate,HR)。1.2.2抗at-1r兔源抗體的制備WKY和SHR大鼠各10只經(jīng)10%水合氯醛(2.5mL/kg)腹腔注射麻醉,常規(guī)灌注、取材將含下丘腦和RVLM的組織塊在冰凍切片機(jī)中作連續(xù)冠狀切片(厚30μm)。切片置于24孔培養(yǎng)板中,用0.01mol/LPBSpH7.4浸洗3次,每次5min。加5%正常山羊封閉血清封閉1h,然后加入抗AT-1R兔源多克隆抗體(1∶500,Chemicon,美國(guó)),4℃孵育36h;PBS洗3次,每次5min;加FITC標(biāo)記山羊抗兔(1∶1000,Sigma,美國(guó)),4℃避光孵育12h,PBS洗3次,每次5min;抗淬滅劑封片。熒光顯微鏡(LeicaDM4000B)觀察、攝片。對(duì)照染色:(1)空白染色:省去AT-1R免疫熒光染色中的一抗,孵育切片。(2)置換染色:用正常兔血清代替兔抗AT-1R血清。1.3對(duì)eica公司的分析免疫熒光切片采用LeicaLAS圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn),顯著性水平設(shè)為α=0.05。2結(jié)果2.1shr-wy檢測(cè)16周齡SHR的MAP為(123.0±3.5)mmHg,低于WKY的(92.4±2.2)mmHg,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明SHR的MAP顯著高于同周齡的WKY大鼠。SHR和WKY的HR分別為(406.8±5.3)bpm和(386.2±8.6)bpm,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2免疫熒光染色對(duì)照試驗(yàn)省去AT-1R免疫熒光染色中的一抗,不出現(xiàn)相應(yīng)的陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果。用正常兔血清代替兔抗AT-1R血清,也為陰性結(jié)果。2.2.1熒光顯微鏡下pamp細(xì)胞免疫陽(yáng)性神經(jīng)元/回復(fù)突變體pva參照Swanson和Kuypers對(duì)大鼠PVN各亞核的劃分標(biāo)準(zhǔn),將PVN分為大細(xì)胞亞核和小細(xì)胞亞核,PVN大細(xì)胞亞核可進(jìn)一步分為室旁核內(nèi)側(cè)亞核(PVM)、室旁核外側(cè)亞核(PVL)、室旁核后亞核(PvPO)。熒光顯微鏡下可見,在兩組大鼠PVN大細(xì)胞部和小細(xì)胞部均有AT-1R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布。在大細(xì)胞部,AT-1R呈楔形集中分布3V的兩側(cè),尤其是PVM和PVL兩亞核分布較多(圖1)。至PvPO水平AT-1R細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞散在分布于PVL背外側(cè)部。而在PaMP小細(xì)胞部也可以觀察到綠色熒光標(biāo)記的AT-1R陽(yáng)性細(xì)胞。AT-1R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元胞體主要為圓形、卵圓形或梭形。SHR組AT-1R免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布較為密集,細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似,兩組大鼠PVN內(nèi)AT-1R免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)見表1。SHR組AT-1R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于WKY組(P<0.001)。2.2.2w東南角細(xì)胞群中at-1r表達(dá)變化SON細(xì)胞群密集分布于大腦底部視交叉(opticchiasma,OC)上方的兩側(cè)。核團(tuán)呈三角形,頂尖向內(nèi)側(cè)傾斜。根據(jù)Nylén等的文獻(xiàn),SON在靠近OC和視束(optictract,Opt)的位置呈現(xiàn)一個(gè)連續(xù)的大細(xì)胞聚集部位,從吻側(cè)到尾側(cè)長(zhǎng)約2.5mm?？煞譃?個(gè)部分:(1)SONa(anteriorpart)即SON吻側(cè)部;(2)SONm(mainpart)是SON細(xì)胞的主部;(3)SONr(retrochiasmaticpart)視交叉后部即SON尾側(cè)部。WKY大鼠AT-1R細(xì)胞群密集分布于OC的背外側(cè)。SON各部均可見AT-1R陽(yáng)性細(xì)胞群(圖2)。SON內(nèi)的AT-1R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元以直徑大于20μm的大細(xì)胞型神經(jīng)元為主。熒光顯微鏡下AT-1R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元發(fā)出綠色熒光,細(xì)胞膜上有綠色的反應(yīng)顆粒分布,胞體主要為圓形或卵圓形,胞漿基本不著色(圖2)。SHR組有大量AT-1R免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布,肉眼觀察SHR組(圖2D-F)AT-1R熒光強(qiáng)度明顯高于WKY組(圖2A-C)。SHR組SON內(nèi)AT-1R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較WKY組多(P<0.05,表1)。2.2.3shr和w地震各組大鼠細(xì)胞的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布熒光顯微鏡下可見WKY和SHR組RVLM均有AT-1R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布。AT-1R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元發(fā)綠色熒光,細(xì)胞膜上有綠色的免疫陽(yáng)性反應(yīng)顆粒分布,胞體主要為圓形或卵圓形(圖3)。在SHR組,RVLM內(nèi)AT-1R免疫陽(yáng)性神經(jīng)元密集分布,細(xì)胞輪廓清晰(圖3C、D),熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng);WKY組免疫陽(yáng)性神經(jīng)元散在分布(圖3A、B),熒光強(qiáng)度較弱。SHR組RVLM內(nèi)免疫陽(yáng)性細(xì)胞較WKY組多(P<0.05,表1)。3ravlm血管緊張素抑制劑近年的研究表明,腦內(nèi)獨(dú)立的RAS系統(tǒng),對(duì)心血管活動(dòng)、水鹽平衡以及內(nèi)分泌功能的中樞調(diào)控起著重要的作用。中樞RAS系統(tǒng)在動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)和原發(fā)性和實(shí)驗(yàn)性高血壓的形成中起重要作用。AngⅡ是一種多肽調(diào)節(jié)物質(zhì),從外周到中樞,對(duì)體內(nèi)水鈉平衡、心血管功能和血壓實(shí)現(xiàn)調(diào)控。放免分析和免疫組化證明:AngⅡ在腦內(nèi)主要分布在與心血管調(diào)節(jié)、水鹽平衡控制有關(guān)的腦區(qū),如下丘腦,腦干和邊緣系統(tǒng)等,其中以下丘腦的含量最高。而AT-1R在大鼠下丘腦、NTS、延髓腹外側(cè)等區(qū)域都有分布。腦內(nèi)有穹窿下器(SFO)-PVN-RVLMAngII升壓系統(tǒng),下丘腦包含了投射到SFO的Ang能神經(jīng)元,刺激外側(cè)下丘腦可通過(guò)PVN而興奮SFO,這很可能是外側(cè)下丘腦/穹窿周圍區(qū)的Ang能神經(jīng)元興奮了SFO-Ang升壓系統(tǒng)。這說(shuō)明下丘腦PVN內(nèi)的Ang能神經(jīng)元與血壓的變化有關(guān)。RVLM已被公認(rèn)是調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)的重要中樞。RVLM位于下橄欖核上端外側(cè),面神經(jīng)核內(nèi)側(cè)下方的近腹側(cè)表面,主要包括巨細(xì)胞旁外側(cè)核和外側(cè)網(wǎng)狀核,RVLM是心交感神經(jīng)元和交感縮血管神經(jīng)元所在的部位。免疫組化研究表明,RVLM存在著血管緊張素免疫反應(yīng)神經(jīng)元和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶,電生理實(shí)驗(yàn)表明,RVLM存在著可被AT-1R激動(dòng)劑興奮的神經(jīng)元。實(shí)驗(yàn)證明,在RVLM給予AngII可引起血壓升高,心率加快,內(nèi)臟交感神經(jīng)活動(dòng)增加,而給予血管緊張素拮抗劑可引起血壓下降,心率減慢。以上反應(yīng)均是SHR比正常血壓的大鼠明顯。因此可得出,內(nèi)源性血管緊張素對(duì)RVLM的心血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)作用。并且RVLM血管運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元血管緊張素傳入增多或(和)對(duì)血管緊張素敏感性增強(qiáng)可能是自發(fā)性高血壓、腎性高血壓的發(fā)病機(jī)制之一。研究顯示成年SHR下丘腦AngⅡ水平高于同齡Wistar鼠,認(rèn)為腦內(nèi)較高水平的AngⅡ含量可能參與了SHR高血壓的形成、維持和發(fā)展。而將AngⅡ受體拮抗劑注入遺傳性低鈉大鼠腦內(nèi),發(fā)現(xiàn)有明顯的降壓效果,而通過(guò)靜脈給藥對(duì)于正常的Wistar大鼠血壓無(wú)影響。有研究進(jìn)一步證實(shí)起升壓作用的主要是AT-1R。上述結(jié)果說(shuō)明,腦內(nèi)AngⅡ受體在高血壓的維持上發(fā)揮著重要作用。在原發(fā)性高血壓狀態(tài)下,腦內(nèi)AT-1R的分布尚缺乏報(bào)道。我們?cè)趯?duì)SHR大鼠的腦內(nèi)心血管核團(tuán)PVN和RVLM的研究中發(fā)現(xiàn):WKY與SHR大鼠在PVN、SON和RVLM都有AT-1R陽(yáng)性細(xì)胞分布,且SHR大鼠AT-1R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較WKY組多。我們推測(cè):SHR下丘腦PVN和SON內(nèi)AngⅡ可與豐富的AT-1R結(jié)合,進(jìn)而通過(guò)促進(jìn)下丘腦AVP的釋