靈芝多糖對(duì)順鉑致嘔吐的抑制作用

靈芝多糖對(duì)順鉑致嘔吐的抑制作用

化療是治療腫瘤的首選方法之一。然而，鉬和其他化療藥物通常會(huì)導(dǎo)致惡心嘔吐和其他副作用，導(dǎo)致患者遭受巨大的痛苦，甚至導(dǎo)致許多并發(fā)癥，如脫水、代謝紊亂和營(yíng)養(yǎng)不良等。治療方案無(wú)法順利實(shí)施，治療效果也難以影響。目前臨床應(yīng)用的5-HT3受體拮抗劑如恩丹西酮(ondansetron)、格拉司瓊(granisetron)等雖有不錯(cuò)的止吐效果,但其價(jià)格昂貴、對(duì)遲發(fā)性嘔吐效果不佳以及對(duì)其安全性的擔(dān)憂(yōu)等尚不能盡如人意;用中醫(yī)藥防治化療所致惡心嘔吐的研究也取得了較好的進(jìn)展,但也存在起效慢,特異性不強(qiáng)等不足,且臨床觀(guān)察居多,機(jī)理探討較少。因此,尋找一種特異性強(qiáng)、安全且能有效防治化療所致惡心嘔吐的藥物,并探討其作用機(jī)制很有必要。靈芝自古以來(lái)就是我國(guó)的名貴藥用真菌,可扶正固本,補(bǔ)益全身五臟之氣(周昌艷等2004),素有“仙草”、“瑞草”之譽(yù)。近來(lái)的研究表明,靈芝提取物(為靈芝多糖、三萜類(lèi)化合物、蛋白質(zhì)等的混合物)與化療藥物順鉑聯(lián)用,能有效減輕化療藥物順鉑引起的大鼠異食癖(一種公認(rèn)的惡心、嘔吐動(dòng)物模型)行為(Wangetal.2005)。人體實(shí)驗(yàn)表明,每天口服靈芝提取物2次,每次2g,連續(xù)服用10d后,其心電圖、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血液和尿液的化學(xué)成分等與服用安慰劑的對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(Wicksetal.2007),說(shuō)明靈芝具有較高的安全性。靈芝多糖是靈芝提取物的重要組分,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷等作用(Liu&Wang2006;Bohetal.2007),但是否具有抑制順鉑所致惡心、嘔吐的效果及其作用機(jī)制如何尚不清楚。本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究靈芝多糖對(duì)順鉑所致高嶺土攝取行為及腦內(nèi)Fos蛋白表達(dá)影響。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性昆明小鼠30只,體重30-40g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK冀20031003)。1.2試劑與試劑盒靈芝多糖粗提物(河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室),順鉑(齊魯制藥有限公司),高嶺土(天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)),阿拉伯樹(shù)膠粉(天津市博迪化工有限公司),鹽酸格拉司瓊注射液(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司),兔抗鼠c-fos抗體(SantaCtuz),SP試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司),DAB(博士德生物工程有限公司)。1.3行為檢測(cè)方法1.3.1高雄花的準(zhǔn)備按照50:1的比例,將高嶺土和阿拉伯樹(shù)膠粉混勻后加入蒸餾水,制成與鼠糧相似的形狀,烘干。1.3.2鹽酸拉德司瓊、順鉑、感官多糖濃度鹽酸格拉司瓊、靈芝多糖和順鉑均用生理鹽水配制,鹽酸格拉司瓊的濃度為2mg/100mL,順鉑濃度為20mg/100mL,靈芝多糖濃度為1g/100mL。1.3.3小鼠的分組和注射購(gòu)入的小鼠分單籠適應(yīng)飼養(yǎng)3d,其間可自由飲水,并給以足量鼠糧和高嶺土。從第4d開(kāi)始,將小鼠分為5組:生理鹽水+生理鹽水組,格拉司瓊+順鉑組,生理鹽水+順鉑組,多糖+生理鹽水組,多糖+順鉑組。每日分2次向小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水或藥物,2次注射的間隔為30min,連續(xù)注射5d,每隔24h稱(chēng)量1次每只小鼠的鼠糧和高嶺土攝食量。各組動(dòng)物的處理方法見(jiàn)表1。1.4fos蛋白免疫組化1.4.1腦片準(zhǔn)備依照耿丹丹等(2006)的方法,在最后一次腹腔注射后1.5h,將小鼠灌流取腦。在滑動(dòng)冰凍切片機(jī)上作冠狀連續(xù)切片,切片厚20μm。1.4.3動(dòng)物腦立體定位圖譜在系統(tǒng)觀(guān)察的基礎(chǔ)上,著重觀(guān)察免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物較多且與內(nèi)臟反應(yīng)相關(guān)的腦核團(tuán):下丘腦室旁核(paraventricularhypothalamicnucleus,PVN)、弓狀核(arcuatenucleus,Arc)、外側(cè)巨細(xì)胞旁核(lateralparagigantocellularnucleus,LPGi)、最后區(qū)(areapostrema,AP)、孤束核內(nèi)側(cè)亞核(nucleusofthesolitarytract,medialpart,SolM)、前庭內(nèi)側(cè)核(medialvestibularnucleus,MVe)、前庭下核(spinalvestibularnucleus,SpVe)、藍(lán)斑(locusceruleus,LC)、臂旁核(parabrachialnucleus,PBN)。每只鼠的每個(gè)核團(tuán)選取4張切片,參照小鼠腦立體定位圖譜盡量使不同動(dòng)物的相應(yīng)切片處于同一平面,以保證所得數(shù)據(jù)的可比性。切片用圖像采集系統(tǒng)拍照,在4080×3072像素下計(jì)數(shù)各核團(tuán)固定面積內(nèi)(PBN為741×753μm,AP為741×541μm,LC為493×461μm,Arc為393×353μm,PVN為421×473μm,LPGi為541×549μm,SolM為517×477μm、SpVe和MVe為1269×665μm)的Fos樣免疫反應(yīng)(Fos-likeimmunoreactivity,FLI)神經(jīng)元數(shù)。1.4.4fli神經(jīng)元計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)小鼠對(duì)高嶺土和鼠糧的攝取量,計(jì)算出各組動(dòng)物高嶺土攝取量占鼠糧攝取量的百分比;將FLI神經(jīng)元的實(shí)際數(shù)目換算為FLI神經(jīng)元數(shù)/mm2。求得的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示,并用STAT軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間差異采用單因素方差分析,樣本均數(shù)間的多重比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1土相對(duì)攝取量生理鹽水+生理鹽水組和多糖+生理鹽水組相比,從第1d到第3d高嶺土相對(duì)攝取量均無(wú)差別,且與適應(yīng)飼養(yǎng)期間基本一致,在第4d生理鹽水+生理鹽水組的高嶺土相對(duì)攝取量多于多糖+生理鹽水組,差異有顯著性(P<0.05)。生理鹽水+順鉑組的高嶺土相對(duì)攝取量在第1d多于其它4組,差異有顯著性(P<0.01);第2d與格拉司瓊+順鉑組之間無(wú)明顯差異,但仍高于其它3組(P<0.05或P<0.01)。多糖+順鉑組與格拉司瓊+順鉑組相比,前者的高嶺土相對(duì)攝取量少于后者,其中第1d其差異有顯著性(P<0.05),第2-4d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多糖+順鉑組與生理鹽水+生理鹽水組相比,前者的高嶺土相對(duì)攝取量在4d內(nèi)均多于后者,但第1-2d其差異有顯著性(P<0.05),第3-4d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多糖+順鉑組與多糖+生理鹽水組相比,前者的高嶺土相對(duì)攝取量在4d內(nèi)均多于后者,但是,在第1d和第3d兩組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),第2d和第4d有顯著性差異(P<0.05)。各組高嶺土相對(duì)攝取量的變化及其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表2。2.2不同核團(tuán)中fli神經(jīng)元計(jì)數(shù)的比較表1本實(shí)驗(yàn)著重對(duì)PBN、AP、LC、SolM、Arc、PVN、LPGi和Mve-SpVe等8個(gè)核團(tuán)內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)進(jìn)行了比較。不同處理組各核團(tuán)內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果顯示,不同處理組間這8個(gè)核團(tuán)內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)目均存在顯著性差異。生理鹽水+順鉑組各個(gè)核團(tuán)內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)最多,且與其它各組間的差異有顯著性(P<0.01);在靈芝多糖+順鉑組,除SolM外其它核團(tuán)內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)目均少于生理鹽水+順鉑組,差異有顯著性(P<0.01)。多糖+生理鹽水組與生理鹽水+生理鹽水組相比,Arc和PVN內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)沒(méi)有差別;在其它核團(tuán)內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù),多糖+生理鹽水組多于生理鹽水+生理鹽水組(P<0.05或P<0.01);多糖+順鉑組和格拉司瓊+順鉑組相比,在PBN、AP、Arc、LPGi內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),多糖+順鉑組LC、SolM、PVN和MVe-SpVe內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)多于格拉司瓊+順鉑組(P<0.05或P<0.01)。圖1顯示了不同處理小鼠PBN內(nèi)的FLI神經(jīng)元分布,以生理鹽水+生理鹽水組(A)、多糖+生理鹽水組(B)的Fos蛋白表達(dá)量最少,生理鹽水+順鉑組(C)的Fos蛋白表達(dá)量最多,多糖+順鉑組(D)與格拉司瓊+順鉑組(E)的Fos蛋白表達(dá)量基本相當(dāng)。3基于順鉑/感官聯(lián)合順鉑5-ht3受體抗劑的抗氧化效力研究惡心(nausea)是一種內(nèi)臟不舒適的感覺(jué),最終以嘔吐(vomiting)達(dá)到高潮。嚙齒類(lèi)動(dòng)物缺乏嘔吐反射,但在受到放射線(xiàn)照射、旋轉(zhuǎn)、催吐劑等能引起嘔吐的刺激時(shí),表現(xiàn)出攝取高嶺土的異食癖(pica)行為,因而將該異食癖行為視為惡心嘔吐反應(yīng)的表現(xiàn),并將減少高嶺土攝取作為篩選抗嘔吐藥物的一種公認(rèn)的重要指標(biāo)(Yamamotoetal.2002)。本實(shí)驗(yàn)中,在注射順鉑前30min,預(yù)先注射靈芝多糖溶液的小鼠,高嶺土相對(duì)攝取量顯著少于生理鹽水+順鉑組,甚至略低于格拉司瓊+順鉑組,說(shuō)明靈芝多糖對(duì)于順鉑所致嘔吐作用的抑制效果,與格拉司瓊相當(dāng)甚至略好。一般認(rèn)為,順鉑的致嘔吐作用與其引起胃腸粘膜和腦內(nèi)某些區(qū)域(如最后區(qū))5-HT的釋放有直接關(guān)系。5-HT作用于迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)纖維上的相應(yīng)受體,使迷走神經(jīng)傳入沖動(dòng)增加,也可直接作用于腦內(nèi)的5-HT3受體,二者共同作用引起惡心等內(nèi)臟不適感覺(jué)和嘔吐反應(yīng)。格拉司瓊等5-HT3受體拮抗劑可通過(guò)阻斷外周和中樞的5-HT3受體發(fā)揮止嘔吐作用。順鉑導(dǎo)致5-HT釋放的機(jī)制還不十分清楚,對(duì)胃腸粘膜特別是對(duì)能產(chǎn)生5-HT的腸嗜鉻細(xì)胞的氧化損傷可能是關(guān)鍵因素。已有報(bào)道指出靈芝多糖具有很好的抗氧化損傷作用(Bohetal.2007;Xieetal.2006),其抗氧化損傷效果也可能是減輕順鉑所致惡心嘔吐的重要原因,但靈芝多糖是否減少了5-HT的釋放,以及對(duì)5-HT3受體是否具有抑制作用尚待進(jìn)一步研究。Fos蛋白是c-fos基因的表達(dá)產(chǎn)物,該基因是一種即刻早期基因,其表達(dá)增強(qiáng)可說(shuō)明在特定條件下有關(guān)神經(jīng)元的活動(dòng)發(fā)生了變化,因此被廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能活動(dòng)的形態(tài)定位。結(jié)果顯示,小鼠腹腔內(nèi)注射順鉑后,所觀(guān)察核團(tuán)內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)明顯增多,如果在注射順鉑之前,預(yù)先給以格拉司瓊或靈芝多糖,各核團(tuán)內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)則顯著減少,其總體變化趨勢(shì)與高嶺土攝取量的變化基本一致,表明Fos蛋白表達(dá)水平反映了順鉑致惡心嘔吐的程度,也進(jìn)一步說(shuō)明靈芝多糖對(duì)于順鉑所致嘔吐作用具有確切的抑制效果。普遍認(rèn)為AP是催吐化學(xué)感受區(qū)(chemoreceptortriggerzone)所在位置,Sol、PBN、Arc等均參與惡心嘔吐反應(yīng),這幾個(gè)核團(tuán)內(nèi)Fos蛋白表達(dá)水平的變化與惡心嘔吐的關(guān)系基本上可以肯定。本研究還發(fā)現(xiàn)注射順鉑使前庭核內(nèi)FLI神經(jīng)元增多,而聯(lián)合應(yīng)用格拉司瓊或靈芝多糖后前庭核內(nèi)FLI神經(jīng)元減少,提示順鉑還可能通過(guò)刺激前庭核引起嘔吐,而格拉司瓊或靈芝多糖減輕順鉑對(duì)前庭核的刺激從而發(fā)揮止吐作用。在注射順鉑,以及給以格拉司瓊或靈芝多糖后其它核團(tuán)內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)發(fā)生變化有何意義尚不清楚,或存在其它值得研究的問(wèn)題。另外,靈芝多糖+順鉑組的高嶺土攝取量在第1d明顯少于格拉司瓊+順鉑組(P<0.05),第2-4d與格拉司瓊+順鉑組之間的差別雖沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但顯示了低于格拉司瓊+順鉑組的趨勢(shì);從腦內(nèi)Fos蛋白表達(dá)水平來(lái)看,靈芝多糖+順鉑組的AP、PBN、Arc和LPGi內(nèi)的FLI神經(jīng)元數(shù)與格拉司瓊+順鉑組之間的差別雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但表現(xiàn)出多于格拉司瓊+順鉑組的趨勢(shì),LC、SolM、PVN和MVe-SpVe內(nèi)FLI神經(jīng)元數(shù)要多于格拉司瓊+順鉑組(P<0.05),這一現(xiàn)象提示靈芝多糖對(duì)順鉑所致惡心嘔吐的抑制作用可能存在與格拉司瓊不同的機(jī)制,例如通過(guò)抗氧化損傷、免疫調(diào)節(jié)作用(Zhuetal.2007)等,提高機(jī)體對(duì)順鉑毒性的耐受性。綜上所述,靈芝多糖可以有效抑制順鉑引起的小鼠高嶺土攝取和腦內(nèi)Fos蛋白表達(dá)增多,對(duì)于預(yù)防和治療化療所致惡心嘔吐具有一定的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。1.4.2兔抗c-fos抗體的檢測(cè)將切片用兔抗c-fos