cyr1與釀酒酵母衰老

cyr1與釀酒酵母衰老

作為一個(gè)細(xì)胞生物模型，有兩種確定遺傳因子的指標(biāo)，一種是復(fù)制率（ris），另一種是序列率（cls）。首先，在細(xì)胞衰老之前，測(cè)量細(xì)胞的子代細(xì)胞數(shù)，即有絲分裂率。后者是在液體培養(yǎng)條件下確定親代細(xì)胞的生存時(shí)間。復(fù)制壽命被認(rèn)為與有絲分裂期組織的衰老相關(guān),而時(shí)序壽命則與有絲分裂后期組織的衰老有關(guān)。卡路里限制(Caloriecestriction,CR)可以干擾和減緩迄今從酵母到小鼠等幾乎所有物種的生存壽命。盡管目前關(guān)于卡路里限制如何調(diào)節(jié)生命周期有很多假說(shuō),但其作用機(jī)制尚無(wú)明確。Min等證明在酵母細(xì)胞中,卡路里限制引起的生命周期延長(zhǎng)與Ras/PKA、Tor和Sch9等傳導(dǎo)途徑相關(guān),Ras/cAMP/PKA/Rim15/Msn2/4和Tor/Sch9/Rim15/Gisl是卡路里限制依賴的兩條主要調(diào)節(jié)途徑。Ras/cAMP/PKA和Tor/Sch9在細(xì)胞保護(hù)、抗氧化和細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用,這些基因與哺乳動(dòng)物Ras、PKA、Tor、Akt以及S6K高度同源,已被證明在人類衰老和相關(guān)疫病中發(fā)揮重要作用。Cyrl編碼酵母腺苷酸環(huán)化酶,腺苷酸環(huán)化酶催化ATP產(chǎn)生cAMP,從而激活cAMP依賴的蛋白激酶活性。腺苷酸環(huán)化酶是膜結(jié)合蛋白,其中Ras結(jié)合區(qū)與Ras相偶聯(lián),受Ras信號(hào)調(diào)節(jié),在cAMP/PKA途徑中調(diào)節(jié)多種代謝途徑,包括細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)和衰老進(jìn)程。線粒體在細(xì)胞衰老中的重要作用已得到廣泛認(rèn)可,在致衰老的內(nèi)、外信號(hào)刺激下,線粒體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,將膜間隙的多種可溶性蛋白釋放入胞漿,其結(jié)構(gòu)和功能的變化對(duì)細(xì)胞衰老的研究有著重要的意義。研究Cyr1如何參與調(diào)節(jié)衰老進(jìn)程以及對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響,對(duì)研究衰老機(jī)制及未來(lái)抗衰老藥物的開(kāi)發(fā)都有重要意義。1材料和方法1.1ura和培養(yǎng)基野生菌DBY746:MATαleu2-3112his3D1trp1-289ura3-52GAL+,Cyr1Δ:MATαleu2-3112his3D1trp1-289ura3-52GAL+cyr1::mTn,來(lái)自Longo實(shí)驗(yàn)室。Ycp50-CYR1(CEN,URA)來(lái)自CarlMann實(shí)驗(yàn)室,所有培養(yǎng)基采用Longo衰老培養(yǎng)基,即在SDC配方基礎(chǔ)上四倍量的色氨酸、亮氨酸、尿嘧啶和組氨酸,因?yàn)镈BY746背景菌是leu2-3,112his3D1trp1-289ura3-52,即leu、his、trp、ura表型缺失,四倍量的四種氨基酸主要是為了消除野生菌的表型缺陷。常規(guī)2%葡萄糖作為碳源,特殊注明的除外。在實(shí)驗(yàn)中充分考慮到為了避免營(yíng)養(yǎng)性缺失可能帶來(lái)的影響,轉(zhuǎn)化了空載體以保證菌株具有相同的遺傳背景。固體培養(yǎng)基為YPD平板,10g/L酵母提取物、20g/L胰蛋白胨、20g/L瓊脂溶解于去離子水中,高壓后加入葡萄糖使其終濃度為2%。每次實(shí)驗(yàn)均從-80℃冰箱中取菌株,涂YPD平板,在30℃溫箱培養(yǎng)2～3d,后取5～6個(gè)克隆接種于2ml的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),制備過(guò)夜飽和培養(yǎng)物(saturatedovernightculture,SONC),用SONC接種衰老培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2培養(yǎng)新鮮的sonp參考Longo方法。新鮮SONC接種于25ml衰老培養(yǎng)基中,起始D600=0.1,第3d當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期并停止分裂時(shí)我們認(rèn)定此時(shí)的生存率為100%,時(shí)間計(jì)算為0天。此后每隔2～3d取50μl樣品,倍比稀釋涂YPD平板,30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d后計(jì)數(shù)克隆,并計(jì)算生存率。在卡路里限制實(shí)驗(yàn)中,新鮮SONC接種衰老培養(yǎng)基后,培養(yǎng)到第3d取樣品計(jì)數(shù)并計(jì)為0d,同時(shí)將酵母細(xì)胞低速離心收集,用去離子水洗3次后,重新接種在25ml去離子水中繼續(xù)培養(yǎng),此過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌。此后每2d更換新的滅菌去離子水做培養(yǎng)基并計(jì)數(shù)克隆數(shù)量、生存率。為消除誤差,每次實(shí)驗(yàn)均需從-80℃冰箱重新取菌,新制備培養(yǎng)基和滅菌水,新鮮的SONC。每個(gè)菌株同時(shí)接種3個(gè)平行培養(yǎng)瓶,每個(gè)培養(yǎng)瓶樣品稀釋并涂2個(gè)平行YPD板計(jì)數(shù)克隆,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。1.3ypd平板觀察H2O2抵抗實(shí)驗(yàn):取1×107酵母細(xì)胞(D600≈1),室溫下135mmol/LH2O2處理1h,去離子水清洗3次,并10×倍比稀釋后涂YPD平板,30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d,照相觀察。熱抵抗實(shí)驗(yàn):從培養(yǎng)瓶中取1ml培養(yǎng)液,在55℃水溫?fù)u床中培養(yǎng)1h,后取1×107細(xì)胞,10×倍比稀釋后涂YPD板,30℃培養(yǎng)2～3d,照相觀察。1.4熒光顯微鏡觀察pYX232-mtGFP是表達(dá)GFP標(biāo)記的線粒體膜蛋白的質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后,熒光顯微鏡觀察。NikonEclipseE00熒光顯微鏡,Apo100×目鏡,1.4倍物鏡。圖像抓拍用SPOTRT9.0onochrome-6相機(jī),MetaMorph(Version6.3.0)軟件。所有圖像用photoshop7.0分析處理。2結(jié)果2.1不同菌株在不同條件下的生存時(shí)間用Longo的衰老培養(yǎng)基培養(yǎng)野生DBY746和Cr1Δ,測(cè)定細(xì)胞時(shí)序壽命。如圖1所示,相比DBY746在第5d8%的生存率,Cyr1Δ有60%的生存率。而第7d野生菌的生存率在3%以下,而Cyr1Δ在第13d生存率才達(dá)到4%左右。Cyr1Δ生存時(shí)間要比DBY746延長(zhǎng)近接近一倍。圖2表示酵母細(xì)胞在強(qiáng)卡路里限制條件下,無(wú)論是DBY746或是Cyr1Δ生存時(shí)間都有延長(zhǎng)。DBY746的第24d生存率降到2%左右,是常規(guī)衰老培養(yǎng)基的生存時(shí)間的3倍,Cyr1Δ在第24d還有59%的生存率,在第51d降到3%的生存率。結(jié)果表明無(wú)論是在正常培育或是在強(qiáng)卡路里限制條件下Cyr1Δ比野生DBY746的有更長(zhǎng)時(shí)序壽命。2.2比dby396菌在對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行時(shí)序壽命測(cè)定的同時(shí),取不同時(shí)間點(diǎn)的酵母細(xì)胞進(jìn)行抗H2O2和熱抵抗實(shí)驗(yàn)。圖3表明,在培養(yǎng)的第1d和第6d,Cyr1Δ比DBY746菌有更強(qiáng)的抵抗能力。同時(shí)檢測(cè)是否這種結(jié)果確實(shí)是由于Cyr1基因的缺失引起的,我們對(duì)CyrlΔ轉(zhuǎn)化了Ycp50-CYR1質(zhì)粒,即恢復(fù)了細(xì)胞內(nèi)CYR1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Cyr1A/CYR1的抗H2O2和熱抵抗的能力恢復(fù)到與野生DBY746相似。驗(yàn)證了Cyr1A對(duì)H2O2和熱的抵抗力是由于Cyr1基因突變引起的。結(jié)果表明Cyr1Δ相比野生DBY746有更強(qiáng)的抗H2O2能力和熱抵抗能力。2.3細(xì)胞內(nèi)中小型糖液cyr1和突變菌的土地財(cái)產(chǎn)形態(tài)檢測(cè)我們對(duì)Cyr1A和DBY746進(jìn)行了碳源選擇實(shí)驗(yàn),分別將酵母菌在含有2%葡萄糖、3%甘油或3%乙醇的YP培養(yǎng)板上培養(yǎng)。圖4表明Cyr1Δ在3%的乙醇的YP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢,在3%甘油培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。這一結(jié)果表明Cyr1Δ不能很好地利用甘油和乙醇,可能意味著其線粒體的功能和結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變,圖5細(xì)胞中轉(zhuǎn)化了可以用來(lái)觀察線粒體膜蛋白結(jié)構(gòu)的GFP標(biāo)記的pYX232-mtGFP后,在不同的培養(yǎng)時(shí)間取細(xì)胞熒光顯微鏡觀察線粒體膜形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的第1d野生和突變菌線粒體膜形態(tài)沒(méi)有太大差別,在第3d野生DBY746的熒光呈現(xiàn)體積較大的量點(diǎn),呈分散分布,有些細(xì)胞內(nèi)甚至看不到熒光標(biāo)記。而Cyr1Δ細(xì)胞的熒光結(jié)果顯示有60%以上的細(xì)胞還呈現(xiàn)完整的點(diǎn)/線連續(xù)狀態(tài),18%呈大點(diǎn)或散點(diǎn),22%沒(méi)有熒光標(biāo)記。3cyr1對(duì)酵母細(xì)胞時(shí)序壽命的影響酵母細(xì)胞中有三個(gè)基因Ras2、Cyr1和Sch9,因他們與哺乳動(dòng)物G蛋白-Ras、腺甘酸環(huán)化酶、絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt高度同源而受到注視,Ras-cAMP途徑在酵母細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮了很大作用。CYR1催化ATP產(chǎn)生cAMP從而激活cAMP依賴的蛋白激酶,即蛋白激酶A,蛋白激酶A廣泛影響其下游的一系列蛋白的活性調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等。我們的研究結(jié)果表明,在Cyr1突變后酵母時(shí)序壽命增加,相應(yīng)的對(duì)抗H2O2和熱能力加強(qiáng),這與Fabrizio等的結(jié)果基本一致,不同的是Fabrizio沒(méi)有關(guān)于在卡路里限制條件下的Cyr1Δ后酵母細(xì)胞的時(shí)序壽命的報(bào)道,也沒(méi)有關(guān)于這種性狀與線粒體膜改變的關(guān)系的報(bào)道。酵母培養(yǎng)過(guò)程中加入2%葡萄糖也是常規(guī)培養(yǎng)條件之一,氨基酸限制或糖的限制也可稱卡路里限制,卡路里限制可以提高從酵母到蠕蟲(chóng)、果蠅、小鼠的生命周期。實(shí)驗(yàn)中我們采用了Min等強(qiáng)卡路里限制法,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看在沒(méi)有任何營(yíng)養(yǎng)成分而只有水的條件下野生DBY746的時(shí)序壽命是在普通培養(yǎng)條件下的3倍左右,Cyr1Δ是4倍左右,可見(jiàn)Cyr1基因在一定程度上參與了卡路里限制的生存時(shí)間延長(zhǎng),但一定還有其他基因同時(shí)參與了調(diào)控,如可能的基因包括Tor1/2、Sch9、Ras2等。生命周期延長(zhǎng)一般同時(shí)伴隨著細(xì)胞對(duì)各種環(huán)境應(yīng)激能力的提高,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,Cyr1Δ相比DBY746都有明顯增加的抵抗熱和H2O2的能力,這說(shuō)明Cyr1直接或間接影響了一些衰老或應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的功能,而且這種調(diào)節(jié)是以副調(diào)控為主。因?yàn)榻湍讣?xì)胞可以利用不同的碳源生長(zhǎng),如甘油、乙醇、乙酸、乳糖等。比較了野生DBY746和Cyr1Δ在乙醇和甘油中的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)Cyr1Δ在乙醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢,在甘油培養(yǎng)基中幾乎不能生長(zhǎng),這讓我們考慮到是否Cyr1Δ的線粒體結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生了改變?