替米沙坦對(duì)東堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)的影響

替米沙坦對(duì)東堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)的影響

阿爾茨海默?。╝d）是一種以認(rèn)知記憶功能減退為主要臨床表現(xiàn)的致命神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知記憶功能低下。其主要病理特征是：體積樣本蛋白（a））積聚和腦內(nèi)膽堿損失。AD發(fā)病率隨著人類現(xiàn)代化和老年化進(jìn)程的加速而逐年攀升,并且有不斷年輕化的趨勢(shì),給家庭和社會(huì)面帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床上治療藥物的種類和療效十分有限,而市場(chǎng)需求逐年增加。因此,尋找更有效的防治AD的藥物具有重要意義。替米沙坦是1型血管緊張素Ⅱ受體(AT1R)拮抗劑,臨床上常用于治療高血壓病。近些年來(lái),文獻(xiàn)不斷報(bào)道,AT1R拮抗劑如纈沙坦、氯沙坦、替米沙坦等可顯著改善轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠或Aβ誘導(dǎo)的癡呆模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶損害,但AT1R拮抗劑是否可以通過(guò)提高中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能改善學(xué)習(xí)記憶損害目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用東莨菪堿誘導(dǎo)的癡呆模型,探究替米沙坦對(duì)對(duì)東莨菪堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)的影響,為進(jìn)一步研究AT1R拮抗劑防治AD奠定基礎(chǔ)。1材料表面1.1y迷刺激器、紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司);MG-3S型Y迷宮刺激器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);16/18型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。1.2以sco鹽酸替米沙坦(telmisartan,Tel,江蘇亞邦愛(ài)普森藥業(yè)有限公司,批號(hào)1105012);東莨膽堿注射液(scopolamine,Sco,上海禾豐制藥有限公司,批號(hào)120503);鹽酸多奈哌齊(安理申,aricept,Ari,衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司,批號(hào)110208A);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20091221);乙酰膽堿試劑盒、乙酰膽堿酯酶試劑盒及考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。1.3動(dòng)物質(zhì)量合格情況ICR小鼠,雄性,清潔級(jí),體質(zhì)量(20±2)g,共40只,由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(蘇)2007-0001。2方法2.1分組及治療方法取清潔級(jí)ICR小鼠40只,體質(zhì)量18～22g,按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,即Sal+Veh組、Sco+Veh組、Sco+Ari組、Sco+Tel(0.70mg·kg-1)組、Sco+Tel(0.35mg·kg-1)組,每組8只。Sco+Veh組、Sco+Ari組、Sco+Tel(0.70mg·kg-1)組、Sco+Tel(0.35mg·kg-1)組腹腔注射東莨菪堿(Sco,1.0mg·kg-1),Sal+Veh組腹腔注射等體積的生理鹽水(Sal)。30min后灌胃給藥,Sco+Ari組灌胃給予安理申(Ari,2mg·kg-1),Sco+Tel(0.70mg·kg-1)組和Sal+Tel(0.35mg·kg-1)組灌胃給予替米沙坦,Sal+Veh組和Sco+Veh組給予等體積的0.5%CMC-Na。腹腔注射和灌胃給藥均每天1次,連續(xù)17d。2.2水迷平臺(tái)訓(xùn)練給藥第8天進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn),為期6d,第1,2天為可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練,第3,4,5天為隱藏平臺(tái)訓(xùn)練,第6天為空間搜索試驗(yàn)。水迷宮試驗(yàn)期間每天繼續(xù)給藥,于灌胃給藥30min后進(jìn)行試驗(yàn)。(1)可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練:將插有旗子的水迷宮平臺(tái)(旗子高于平臺(tái)5cm)置于水迷宮第4象限,放入25℃左右水至沒(méi)過(guò)平臺(tái)5mm。每天從1,2,3,4四個(gè)象限(4個(gè)入水點(diǎn))分別將小鼠面向池壁放入水中,使其自由游泳90s,90s內(nèi)小鼠找到平臺(tái)并上臺(tái)停留10s后將其從平臺(tái)上取下休息,計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)并記錄小鼠從入水開(kāi)始至爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(潛伏期)及穿越平臺(tái)的次數(shù)等數(shù)據(jù)。若90s內(nèi)動(dòng)物未找到平臺(tái),則將小鼠引到平臺(tái),并停留30s,潛伏期記為90s。(2)隱藏平臺(tái)訓(xùn)練:將未插有旗子的水迷宮平臺(tái)置于水迷宮第4象限,放入25℃左右水至沒(méi)過(guò)平臺(tái)5mm。訓(xùn)練方法同可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練。(3)空間搜索試驗(yàn):試驗(yàn)第6天撤除平臺(tái),任選一象限將各組小鼠依次從該象限面向池壁放入水中,使其自由游泳90s,記錄小鼠在第4象限停留的時(shí)間占總時(shí)間的百分比(行為學(xué)測(cè)試過(guò)程中應(yīng)保持光線柔和,房間安靜,各參照物位置不變)。2.3y迷覺(jué)神經(jīng)并誘導(dǎo)試驗(yàn)Morris水迷宮試驗(yàn)后進(jìn)行Y迷宮試驗(yàn),Y迷宮電壓設(shè)置10V,電擊延遲時(shí)間為2s,試驗(yàn)為期2d,第1天為訓(xùn)練,首先將小鼠放入Y迷宮,適應(yīng)環(huán)境5min,然后將小鼠置于某一臂作為起點(diǎn)區(qū),進(jìn)行電擊,其一次逃至安全區(qū)為正確反應(yīng),否則記為錯(cuò)誤反應(yīng)。電擊每次間隔30s,依次重復(fù),連續(xù)訓(xùn)練10次。第2天為測(cè)試,此次無(wú)需適應(yīng)5min,實(shí)驗(yàn)操作和方法同第1天,記錄小鼠在連續(xù)10次電擊中的正確逃避次數(shù)。2.4ach含量測(cè)定將小鼠斷頭取腦,用預(yù)冷生理鹽水沖洗表面血液,分離海馬和皮層,取一部分樣本以質(zhì)量/體積比1∶9加入裂解液,制成約10%勻漿,3500r·min-1、4℃離心15min,取上清液,按試劑盒說(shuō)明規(guī)定的方法測(cè)定ACh含量。另一部分樣品以質(zhì)量/體積比1∶9加入4℃生理鹽水,制成約10%的勻漿,3500r·min-1、4℃離心15min,取上清液,按試劑盒說(shuō)明規(guī)定的方法測(cè)定AChE含量。并用考馬斯亮藍(lán)定量蛋白。2.5.5統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均用xˉ±sxˉ±s表示。采用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P<0.05表示差異有顯著性,P<0.01表示差異有極顯著性。3小鼠在原平臺(tái)所在限定停留時(shí)間百分率和穿越平臺(tái)次數(shù)試驗(yàn)在可見(jiàn)平臺(tái)訓(xùn)練中,各組小鼠的訓(xùn)練潛伏期無(wú)顯著差異(P>0.05,n=8),見(jiàn)圖1,說(shuō)明各組小鼠對(duì)目標(biāo)的識(shí)別能力和色覺(jué)均正常。在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)中,試驗(yàn)第2天,Sal+Veh組和Sco+Ari組潛伏期均小于Sco+Veh組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=8),試驗(yàn)第3天,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)組和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)組小鼠的潛伏期均小于Sco+Veh組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,n=8),見(jiàn)圖2。在空間探索試驗(yàn)中,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)組和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)組小鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分率及穿越平臺(tái)次數(shù)均顯著大于Sco+Veh組(P<0.05,P<0.01,n=8),見(jiàn)圖3～5。如圖2所示,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)組和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)組較Sco+Veh組正確反應(yīng)次數(shù)顯著增加(P<0.05,P<0.01,n=8),見(jiàn)圖6。Morris水迷宮和Y迷宮試驗(yàn)結(jié)果提示,替米沙坦(0.35～0.70mg·kg-1)對(duì)東莨菪堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶損害有顯著改善作用。與Sco+Veh組比較,Sco+Tel(0.70mg·kg-1)組和Sco+Tel(0.35mg·kg-1)組小鼠腦組織海馬區(qū)和皮層區(qū)ACh含量顯著增多(P<0.05,P<0.01,n=4),而AChE活力顯著下降(P<0.05,n=4)(表1),提示,替米沙坦可抑制東莨菪堿模型小鼠腦內(nèi)AChE活性,提高ACh含量。4東堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶損害的活性基底前腦膽堿能神經(jīng)元退變、丟失是AD患者學(xué)習(xí)記憶損害的主要原因之一,ACh及其受體在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)中發(fā)揮著十分重要的作用。提高ACh及其受體功能的藥物如膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊、利斯的明等)是目前臨床上治療AD的一類重要藥物。東莨菪堿為非選擇性M受體阻斷劑,可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞,阻斷中樞ACh與其受體的結(jié)合,破壞大腦皮層和海馬等部位的膽堿能神經(jīng)信號(hào)傳遞,使學(xué)習(xí)記憶功能下降。東莨菪堿用于誘導(dǎo)動(dòng)物記憶損害模型具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、方便等優(yōu)點(diǎn),故常應(yīng)用于抗AD活性化合物的初步篩選。AT1R拮抗劑替米沙坦脂溶性較高,較其他AT1R拮抗劑更易通過(guò)血腦屏障。值得注意的是,我們使用的替米沙坦劑量非常低(0.35～0.70mg·kg-1·d-1),僅相當(dāng)于抗高血壓劑量的1/60～1/30,因此,替米沙坦改善東莨菪堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶損害的同時(shí)不影響血壓。本研究發(fā)現(xiàn),替米沙坦通過(guò)降低AChE活性提高膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACh含量,改善東莨菪堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶損害。