糖尿病大鼠下丘腦室旁核神經(jīng)元型一氧化氮合酶的變化

糖尿病大鼠下丘腦室旁核神經(jīng)元型一氧化氮合酶的變化

據(jù)報(bào)道，在糖尿病狀態(tài)下，各種神經(jīng)流暢質(zhì)子和激素的合成、釋放和代謝異常，如乙酰膽堿、腎上腺素、脫甲基腎上腺素、血管壓迫素和腎上腺激素釋放激素。它表明大腦中的神經(jīng)流暢質(zhì)子和氨基酸的變化可能與糖尿病的不同過(guò)程有關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的NO可參與外周血糖和血漿滲透壓調(diào)節(jié)，在具有高血糖、高血漿滲透壓、多食、多飲、多尿等臨床表現(xiàn)的糖尿病病變過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)ABC免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察了糖尿病大鼠下丘腦室旁核（PVN）內(nèi)神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的變化。1材料和方法1.1枸杞酸鈉緩沖液溶液鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，以0.1mol/LpH4.2枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液新鮮配成2%的溶液。葡萄糖酶法測(cè)定試劑盒（批號(hào)000302）購(gòu)自上海捷門生物技術(shù)公司。1.2大鼠免疫指標(biāo)檢測(cè)36只健康雄性SD大鼠（購(gòu)自第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量（200±20)g，隨機(jī)均分為2組。（1）糖尿病組：大鼠禁食12h后一次性腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素55mg/kg·b.w.。（2）對(duì)照組：注射同等體積0.1mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。第10天時(shí)血糖≥16.65mmol/L者確定為糖尿病大鼠。成模后每周監(jiān)測(cè)1次定性尿糖和體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)期間對(duì)糖尿病大鼠未使用胰島素治療。1.3腦組織病理學(xué)檢測(cè)于成模后第2、7、12周，即糖尿病早、中、后期，兩組各取6只動(dòng)物，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下開(kāi)胸。用無(wú)菌注射器從左心室內(nèi)采血5ml，室溫靜置析出血清，10000r/min離心，提取上清，-70℃低溫冰箱內(nèi)保存。常規(guī)灌注固定取腦，入4%多聚甲醛后固定，置于4℃冰箱內(nèi)保存。腦依次置于含10%、20%、30%蔗糖液（0.1mol/LPB配制）過(guò)夜至沉底。將組織塊以O(shè).C.T.包埋，-204℃恒冷箱中全腦連續(xù)冠狀切片，片厚35μm，隔6取1，收集所有切片，保存于0.01mol/LPBS。每個(gè)組織塊依次取兩套切片，一套做nNOS免疫組織化學(xué)染色，另一套做尼氏染色。1.4血液測(cè)試血清葡萄糖測(cè)定采用葡萄糖酶法。具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。1.5uz羊血清免疫細(xì)胞化學(xué)染色采取漂浮染色法，具體步驟如下：漂片入0.1%H2O2溶液，室溫下保存1h;1.5%正常羊血清（不漂洗），室溫下保存2h；兔抗nNOS多克隆抗體（SantaCruz公司），工作濃度1∶2000(PBT液稀釋），4℃濕盒孵育96h(PBT液配制：0.1%BSA,0.1%TritonX-100,0.01mol/LPBS稀釋)；1∶200生物素結(jié)合IgG,4℃濕盒孵育48h;1∶50ABC混合液，4℃濕盒孵育24h；上述各步驟除正常羊血清外，皆用0.01mol/LPBS(pH=7.2)漂洗5min×3;DAB顯色，鏡下控制呈色程度。裱片，自然干燥，常規(guī)脫水、透明、封片。對(duì)照實(shí)驗(yàn)：陰性對(duì)照用0.01mol/LPBS代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照由一抗試劑盒提供。1.6兩側(cè)pvn斷面免疫陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)每只大鼠選取5張PVN斷面切片，置Olympus顯微鏡下觀察免疫陽(yáng)性神經(jīng)元，僅計(jì)數(shù)10×40倍光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核輪廓清晰的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元。每張切片兩側(cè)PVN斷面免疫陽(yáng)性神經(jīng)元均計(jì)數(shù)3次，取其均值作為兩側(cè)PVN斷面的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目（A、B）。按下述公式計(jì)算一側(cè)PVN所含免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的平均數(shù)Gn，代表該只大鼠PVN內(nèi)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目：Gn=ΣSn/N。其中Gn為一側(cè)PVN所含免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的平均數(shù)；Sn為每張切片兩側(cè)PVN斷面所含免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均數(shù)，Sn=（A+B）/2；ΣSn為所有切片中PVN兩側(cè)核團(tuán)斷面所含免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均數(shù)之和；N為觀察PVN的總切片數(shù)，N=5。1.7處理數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主效應(yīng)與交互效應(yīng)分析用重復(fù)測(cè)量方差分析，單獨(dú)效應(yīng)分析用兩樣本t檢驗(yàn)和重復(fù)測(cè)量方差分析。2結(jié)果2.1糖尿病大鼠血糖比較整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組血糖值維持在正常水平；而糖尿病組大鼠血糖明顯升高，始終處于高血糖水平（高于16.65mmol/L），與對(duì)照組相比有顯著差異（表1）。2.2糖尿病大鼠pvn內(nèi)nns免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目PVN內(nèi)分布有大量的nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元，nNOS免疫陽(yáng)性物質(zhì)為深棕色，定位于胞質(zhì)，胞核周圍著色明顯，胞核不著色。nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布PVN的大細(xì)胞部，尤以腹內(nèi)側(cè)明顯，密集分布，胞體大，卵圓形，突起較短，可見(jiàn)突起伸向第三腦室；PVN小細(xì)胞部散在分布少量免疫陽(yáng)性神經(jīng)元，胞體中等大小，橢圓或梭形，長(zhǎng)軸多呈內(nèi)外走向。定量結(jié)果顯示（表2），對(duì)照組PVN內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目無(wú)明顯改變。在糖尿病早期（2周），糖尿病組PVN內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）。糖尿病中期（7周），糖尿病組PVN內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比均有顯著差異（P>0.05）。糖尿病后期（12周），糖尿病組PVN內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目雖然低于中期，仍然高于對(duì)照組，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比有顯著差異（P>0.05）。對(duì)照組和糖尿病組nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)見(jiàn)圖1～4。3免疫陽(yáng)性神經(jīng)元PVN為異質(zhì)性核團(tuán)，既具有神經(jīng)內(nèi)分泌功能，又參與植物神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)控，是神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位之一。除血管加壓素（AVP）和催產(chǎn)素（OT）外，PVN還可合成生長(zhǎng)抑素、腦啡肽、心房肽等神經(jīng)肽類物質(zhì)，參與神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)。PVN接受多重神經(jīng)支配，并富含催產(chǎn)素、GABA能神經(jīng)元及兒茶酚胺能神經(jīng)末梢，提示下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)存在多種突觸調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，NOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布于PVN的所有亞核內(nèi)，主要集中于PVN的大細(xì)胞部，而大細(xì)胞部主要含AVP和OT神經(jīng)元，提示PVN大細(xì)胞部的nNOS神經(jīng)元可能與AVP和OT神經(jīng)元部位重疊。本研究觀察到nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布于PVN的大細(xì)胞部，支持以上觀點(diǎn)。另外，本研究結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠成模2周時(shí)PVN內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目未見(jiàn)顯著改變，而7周、12周則顯著高于對(duì)照組。提示在糖尿病早期，PVN內(nèi)nNOS尚未激活；在糖尿病中、后期nNOS活性增加。有報(bào)道成模4周時(shí)糖尿病大鼠PVN內(nèi)nNOSmRNA表達(dá)上調(diào)，用胰島素治療使血糖恢復(fù)正常可抑制此反應(yīng)，提示PVN內(nèi)nNOS神經(jīng)元參與了糖尿病的發(fā)生發(fā)展。糖尿病PVN內(nèi)nNOS活性的改變，可能與交感神經(jīng)機(jī)制活性改變有關(guān)。PVN源性的NO對(duì)交感神經(jīng)活動(dòng)可能具有抑制性調(diào)節(jié)機(jī)制，在束縛應(yīng)激大鼠，多個(gè)交感神經(jīng)中樞（如PVN）的NOS神經(jīng)元活性增加，提示NO直接或間接參與各級(jí)中樞水平的交感神經(jīng)活動(dòng)。慢性腎衰大鼠出現(xiàn)高血壓時(shí)，PVN內(nèi)NOSmRNA、NO2-/NO3-量均明顯增高，NOS抑制劑L-NAME可增加PVN內(nèi)NE水平。PVN內(nèi)NO抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的機(jī)制可能包括GABA途徑和Glu/NMDA途徑。研究表明NO可刺激GABA釋放，引起GABA突觸后效應(yīng)。激活GABA受體可消除PVN內(nèi)注射L-NAME產(chǎn)生的增加動(dòng)脈壓和心率作用；阻斷GABA受體可消除NO供體SNP降低動(dòng)脈壓和心率的作用。PVN的NOS神經(jīng)元有NMDA受體，Glu可通過(guò)激活NMDA受體，刺激NOS神經(jīng)元釋放NO。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，在糖尿病早期，以上因素改變尚不足以激活PVN內(nèi)nNOS。隨著糖尿病狀態(tài)持續(xù)存在，交感神經(jīng)途徑活性增強(qiáng)，腦內(nèi)兒茶酚胺增多，AVP