大鼠丘腦束旁核神經元5-h1a受體mrna不同時間點表達的變化

大鼠丘腦束旁核神經元5-h1a受體mrna不同時間點表達的變化

心肌缺血是缺血性心臟?。╥wd）的直接導致因素。機體對心肌缺血的感受是由復雜的神經、化學和生物學活動完成的。5-HT(5-羥色胺)是一種在中樞神經系統(tǒng)具有鎮(zhèn)痛作用的神經遞質,5-HT能神經元在中樞神經系統(tǒng)分布較為廣泛。5-HT的鎮(zhèn)痛作用是通過與其受體結合來實現(xiàn)的。5-HT1A受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體族,其廣泛分布于腦內與疼痛有關的結構。丘腦束旁核(parafascicularnucleus,Pf)是內臟痛覺重要的整合中樞,以往對Pf的研究多采用神經電生理的方法,用原位雜交的方法來研究心肌缺血不同時點大鼠Pf神經元5-HT1A受體mRNA表達變化的研究鮮有文獻報道。本實驗旨在采用原位雜交技術來研究急性心肌缺血時大鼠Pf神經元5-HT1A受體mRNA表達的變化,以探討在急性心肌缺血傷害性刺激作用下,大鼠Pf中5-HT1A受體在痛覺調制中所起的作用及其機制。1材料和方法1.1小鼠骨髓內血流學模型采用健康成年雄性SD大鼠24只(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供),體質量260～280g。隨機分為四組:對照組(C組)、扎閉冠狀動脈(coronaryarteryocclusion,CAO)1h組(CAO1h組)、扎閉冠狀動脈3h組(CAO3h組)、扎閉冠狀動脈6h組(CAO6h組)。將動物麻醉(25%烏拉坦1.2g/kg,ip)后行氣管切開,控制呼吸(RR75次/min,VT8mL/kg)。在左胸骨旁第4～5肋間作1cm長切口,暴露心臟,剪開心包膜后用7-0無損傷縫線結扎冠狀動脈左前降支(對照組動物僅在冠狀動脈下穿線,不結扎),并計時。然后逐層關胸,行胸腔負壓引流后,解除人工通氣,動物恢復自主呼吸。每小時經尾靜脈補給林格液1mL。所有手術切口均用0.125%布比卡因施以局部麻醉,總量不超過1mL。1.2開顱腦表面pf、德國濕、細腦表面下pf、ld5的微電極圖5將心肌缺血的大鼠固定于立體定位儀(ST-7型,日本成茂產品)上。依照大鼠腦立體定位圖譜(以前囟為0點,距前囟向尾側4.0～4.2mm、距中縫旁開0.8～1.2mm、腦表面下5.5～6.5mm),鉆孔開顱顯露腦組織,用單腔玻璃管微電極(尖端直徑0.5～1.0μm)由微推進儀從腦表面垂直刺入,到達Pf位置后以微電泳(10μA,20min)法行ChicagoBlue電極尖端位置標定。到達規(guī)定的時點后處死動物,取出心臟和大腦做組織學檢查和鑒定。1.3腦塊沉底、固定經主動脈根部灌注4℃4%多聚甲醛固定液300mL,取腦修塊,把含有Pf的腦塊置于前述固定液中后固定10min;然后入4℃30%蔗糖(0.1mol/LPBS配制)中過夜至腦塊沉底。然后用恒冷箱切片機(LeicaCM-1850,德國Leica公司)行15μm厚冠狀冰凍連續(xù)切片,室溫下空氣中風干,-70℃保存。1.4制備7個月期雜交的設樣雜交前,室溫平衡,孵育在2×SSC5min×2;切片入新鮮配制的0.3%H2O2的甲醇溶液中滅活內源性的過氧化物酶,室溫下30min,雙蒸水洗滌3次;切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶以暴露mRNA核酸片段,37℃120s,原位雜交用PBS(0.5mol/LPBS)沖洗5min×3,雙蒸水洗1次;每張切片滴加20μL預雜交液,恒溫箱內孵育3h,吸去多余液體,不洗;每張切片滴加20μL雜交液,加蓋原位雜交專用蓋玻片,37℃恒溫箱內雜交12h,揭掉蓋玻片,2×SSC洗滌5min×2,0.5×SSC洗滌15min×1,0.2×SSC洗滌15min×1;滴加封閉液,37℃30min,吸去多余液體,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60min,0.5mol/LPBS沖洗5min×4;滴加SABC,37℃20min,0.5mol/LPBS沖洗5min×3;滴加生物素化過氧化物酶,37℃2min,0.5mol/LPBS沖洗5min×4;DAB顯色,鏡下適時終止,蘇木素復染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性塑膠封片。每一組均設立試劑(陰性)對照(未使用含有寡核苷酸探針的5-HT1A受體mRNA原位雜交用的雜交液)。5-HT1A受體mRNA原位雜交檢測試劑盒、原位雜交專用蓋玻片、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司,DEPC購自sigma公司。1.5半定量分析用BX51-型Olympus光學顯微鏡高倍鏡下(×400)結合IDA-2000數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)(中科院北京空?？萍及l(fā)展有限公司)對Pf部位5-HT1A受體mRNA染色陽性的細胞進行半定量分析。通過組織切片上的電極標記點確認Pf位置,隨機選取以標記點為中心的周圍6個視野,每張切片隨機分析包括標記點在內的7個視野。1.6統(tǒng)計學方法所有數(shù)據均用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包行單因素方差分析,并做多重比較。如果方差齊,采用LSD法;如果方差不齊,則采用Games-Howell法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1原始位異交3-ht1a受體由心肌缺血引發(fā)的心絞痛是常見的臨床癥狀,而心肌缺血本身是一個非常復雜的病理生理過程。在心肌缺血性疼痛的產生、傳導和調制過程中,伴隨著大量神經遞質及其受體的活動。5-HT及其受體是與痛覺調制有重要關系的經典的神經遞質受體系統(tǒng),5-HT主要是通過與5-HT受體結合來發(fā)揮其作用。關于5-HT在脊髓以上水平對內臟痛覺的調制作用研究較少,現(xiàn)有結果較為一致,即腦內5-HT主要參與鎮(zhèn)痛作用,但不同類型5-HT受體在痛覺生理和病理生理中則發(fā)揮不同的作用。目前發(fā)現(xiàn),哺乳動物神經系統(tǒng)中的5-HT受體至少分為7個族14個亞型,這些受體均已被克隆成功。腦內5-HT1A受體則主要分布于海馬、中縫大核(NMR)、中縫背核(DRN)、導水管周圍灰質(PAG)、嗅球、隔區(qū)、腳間核、杏仁核、下丘腦和整個皮層,在脊髓則分布于從頸髓到骶髓的全層,其中以低位胸、腰和骶髓背角的I～V層最多;而5-HT神經元胞體主要集中于中腦下部、腦橋上部和延髓的中縫核群。5-HT能神經元的傳出纖維分上行和下行兩部分。向上可投射到大部分邊緣腦區(qū)、PAG、下丘腦后區(qū)、小腦,向下則投射到脊髓背角、側角和前角。盡管分布如此廣泛,但中樞神經系統(tǒng)的5-HT只占全身總量的1%～2%。5-HT1A受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體族,其在中樞神經系統(tǒng)中的作用都是通過與Gp(Gs或Gi)偶聯(lián)激活或抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC),使細胞內c-AMP水平發(fā)生改變,導致K+電導降低或Cl-電導增加等;然而Peroutka認為,5-HT1A受體僅與Gi相偶聯(lián)而抑制AC,開放胞膜K+離子通道,不能與Gs相偶聯(lián)激動AC。此外,5-HT1A受體還有可能與Go偶聯(lián),關閉Ca2+離子通道。因此,5-HT1A受體在受體水平是多功能的。脊髓是傷害性刺激傳導和調制的必經通路,但關于5-HT1A受體在脊髓水平的痛覺調制中究竟是介導抗傷害作用、還是介導痛覺易化作用仍然存在較多的矛盾,5-HT1A受體有可能單獨或者與5-HT1B受體共同作用而介導鎮(zhèn)痛或痛覺易化作用。大鼠脊髓蛛網膜下腔注射5-HT1A受體拮抗藥,可顯著阻斷側腦室注射選擇性μ型激動藥,羥甲芬太尼的鎮(zhèn)痛效應,提示脊髓5-HT1A受體參與腦內μ型激動藥,所產生的鎮(zhèn)痛效應。Pf是內臟痛覺感受、調制和整合的重要中樞。因此在脊髓上水平,尤其是在Pf水平來研究5-HT1A受體作用及其機制的研究就顯得更為必要。研究表明,Pf內含有豐富的5-HT能神經末梢和受體。5-HT1A受體可分布在突觸前膜或突觸后膜,若分布在5-HT神經元胞體上,則稱為自身受體。腦干的5-HT1A受體激活抑制5-HT神經元的電沖動,從而使5-HT神經遞質釋放減少;而分布在突觸后膜上的5-HT1A受體激動后除了調節(jié)5-HT的釋放外,還能引起NE的釋放,從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。然而,也有大量的研究認為,5-HT1A受體對抗傷害感受起抑制作用,但關于5-HT1A受體激動藥削弱嗎啡鎮(zhèn)痛作用的機制尚不清楚。本實驗研究結果顯示,對照組Pf中5-HT1A受體mRNA的表達處于較低水平,而CAO后則顯著增加。Korzeniewska等的研究表明,5-HT1A受體在內臟痛模型的大鼠行為反應中發(fā)揮著重要的抑制性作用。雷亞娟等的研究提示,5-HT1A受體激動藥烏拉地爾對Pf痛敏神經元的放電具有抑制作用,并被5-HT拮抗藥美西麥角所逆轉。張玉秋等采用原位雜交的方法觀察到5-HT1A受體mRNA在正常大鼠的脊髓背角、NRM、DRN和PAG內均有少到中等程度的表達,角叉菜膠致炎后3h,上述部位5-HT1A受體mRNA的表達明顯增多,8h達高峰,24h仍有較高表達。此外,原位雜交結合免疫組化雙重標記法研究顯示,這些部位的5-HT1A受體mRNA主要分布在5-HT陽性神經元上。本實驗中則觀察到CAO1h后Pf5-HT1A受體mRNA表達即顯著增加,可能是因為使用的動物模型不同、觀察部位和觀察時點也不一樣所導致的。冠狀動脈阻塞造成心肌缺血后,隨著心臟代謝功能的變化,各種痛敏介質和促炎物質通過多種途徑釋放出來,通過外周和中樞敏感化的機制,造成大量化學性傳入通路的激活,從而引起心絞痛的傳入沖動增加,通過Pf與PAG、NMR、腦干網狀結構、大腦皮層以及脊髓灰質等之間廣泛的神經纖維聯(lián)系,使其接受的傷害性刺激也增加,最終導致Pf5-HT1A受體mRNA的轉錄和合成增加、表達增多。這種5-HT1A受體合成和表達的增加很可能是通過負反饋作用來限制炎癥和疼痛導致的5-HT的過度釋放,從而使內源性5-HT的作用保持某種平衡。劉保堅等認為,中樞5-HT1A受體激動后,通過抑制5-HT的釋放來調節(jié)交感和迷走神經的活動,使交感神經活性降低,心肌缺血傷害性刺激傳入沖動減少。新近的研究也表明,激動腦內5-HT1A受體產生鎮(zhèn)痛效應,并且與ATP敏感的K+離子通道的開放有關。本實驗中還觀察到:CAO后隨著心肌缺血時間延長,大鼠Pf中5-HT1A受體mRNA的表達也逐漸增加,在CAO后6h表達明顯高于CAO后3h和1h。分析其原因,可能是因為心肌缺血引起心肌局部組織損傷,各種炎性物質、細胞因子和痛敏介質引發(fā)心肌炎癥反應,從而導致心絞痛的外周敏感化,并通過所謂的“神經源性炎癥”機制引起心臟神經纖維末梢中P物質和CGRP的釋放,進一步加重心肌組織損傷。另一方面,心肌組織損傷以及炎癥反應時,NMDA受體和神經激肽受體介導了炎性內臟痛的中樞敏感化,從而導致心臟傳入沖動的進一步增多。本實驗的觀察時限為6h,未能觀察到這種增加趨勢的全過程,有待于進一步研究。4大鼠pf5-ht1a受體mrna單純心肌缺血即可明顯誘發(fā)大鼠Pf部位5-HT1A受體mRNA的表達,5-HT1A受體參與了急性心肌缺血性疼痛/傷害刺激在大鼠Pf的調制。組織切片背底清晰,呈淺藍色或不著色,對照組中有染色陽性神經元無規(guī)律地零星、散在分布,胞漿不著色或輕度著色,胞核淺淡,神經元形