檳榔口腔癌的機制及治療研究進展

檳榔口腔癌的機制及治療研究進展

咀嚼是中國的一種傳統(tǒng)習俗，主要流行于南亞、亞太地區(qū)、南非、臺灣和湖南省以及中國的臺灣和湖南。咀嚼檳榔可引起口腔黏膜下纖維化(oralsubmucousfibrosis,OSF),OSF是一種癌前病變,經(jīng)過長期的慢性病理過程可惡變?yōu)榭谇话＞捉罊壚浦阅軐е驴谇话?是因為檳榔中的多種活性成分和代謝產(chǎn)物有細胞毒性、遺傳毒性甚至直接致癌性,這些物質包括檳榔生物堿、檳榔鞣質、檳榔特異性亞硝胺(areca-specificnitrosamine,ASNA)和活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)等。檳榔為一級致癌物。1一般廣東潮1.1依堿類堿檳榔生物堿是檳榔主要的活性物質,目前已發(fā)現(xiàn)7種,依次為檳榔堿(arecoline,ARC)、檳榔次堿、去甲檳榔堿、去甲檳榔次堿、異去甲檳榔次堿、檳榔副堿和高檳榔堿。其中,質量最多研究最廣的是ARC。1.2出口癌前病機體外研究證實,ARC具有明確的遺傳毒性和致突變性。將中國倉鼠卵細胞暴露在含ARC(0.03~0.64mmol·L-1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h,可發(fā)現(xiàn)明顯的染色體畸變和姐妹染色單體交換。將人口腔上皮癌細胞暴露于0.3mmol·L-1ARC中24h后,超過50%的細胞停滯于有絲分裂前中期,子代細胞有微核和非整倍性等多種染色體畸變。ARC和檳榔次堿還可誘發(fā)鼠傷寒沙門菌株突變及中國倉鼠V79細胞抗8-氮鳥嘌呤突變。更重要的是,ARC對檳榔咀嚼物的主要靶細胞成纖維細胞有明確的致突變性,表現(xiàn)為非程序性DNA合成。此外,ARC對包括口腔成纖維細胞和角質形成細胞在內的多種細胞具有細胞毒性,影響細胞增殖周期,誘導程序性細胞死亡。ARC在0.02~0.12mmol·L-1時抑制15%~75%上皮細胞的生長,大于0.2mmol·L-1時可引起口腔成纖維細胞和上皮細胞G2/M周期停滯。這種細胞周期失控可能在口腔癌的發(fā)病機制中起著關鍵性的作用。含有包括ARC在內的檳榔大部分有效成分的檳榔提取物(arecanutextract,ANE)對口腔角質形成細胞有細胞毒作用,以濃度-效應依賴關系抑制人口腔角質形成細胞增殖。ARC除能誘導人口腔角質形成細胞非程序性死亡外,還能誘導角質形成細胞和人臍靜脈內皮細胞程序性死亡,靜脈內皮細胞和角質形成細胞程序性死亡異?？赡苁前┣安∽僌SF的重要發(fā)病機制之一。ARC還可調節(jié)多種細胞因子分泌。ARC和ANE可抑制胸腺依賴淋巴細胞(簡稱T細胞)活化和促進生成白細胞介素(interleukin,IL)-6、地諾前列酮(舊稱前列腺素E2)、腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)-α,從而引起口腔黏膜炎癥并影響口腔成纖維細胞和上皮細胞生長。這可能是OSF和口腔癌發(fā)生的原因之一。1.3遺傳毒性及致癌性Bhide等通過管飼法給予雄性Swiss小鼠ARC每天1mg,5周后,43%的小鼠發(fā)生肝血管瘤、肺腺癌和胃鱗狀細胞癌,但未能誘發(fā)雌性Swiss小鼠腫瘤,這說明小鼠在對ARC的反應上可能存在性別差異;然而,ARC誘導口腔癌的動物模型至今尚未建立,可能與檳榔咀嚼過程難以模擬及致癌過程較為漫長有關。關于ARC遺傳毒性乃至致癌性的具體細胞和分子機制十分復雜,現(xiàn)總結如下:1)抑制p53和p21(WAF1)等DNA修復基因,激發(fā)DNA損傷,導致遺傳毒性;2)紡錘體組裝檢查點基因失控,引起染色體畸變,導致基因組不穩(wěn)定;3)調控催化組蛋白甲基化、乙?；兔摷谆缺碛^基因組的表達,部分引起細胞毒性和遺傳毒性;4)調控多種細胞因子分泌,導致免疫功能惡化;5)亞硝化形成致癌劑ASNA;6)通過ROS抑制腺苷酸激活性蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,AMPK),誘導程序性細胞死亡;7)誘導生成ROS,其自身具有致癌性。2檳榔2.1酚類化合物的種類檳榔中鞣質(又稱單寧、鞣酸)含量最豐,屬于多酚類化合物,有水解型和縮合型兩類。水解型鞣質有沒食子酸和沒食子鞣酸等;而縮合型鞣質主要為原花青素,包括兒茶精、表兒茶精及其低聚體和多聚體等。2.2ames試驗檳榔鞣質有否遺傳毒性和致突變性至今仍有爭議,不同類型的短期篩選試驗結果差異很大。檳榔鞣質可引起人淋巴細胞微核形成,而在SOS試驗中卻顯示其無遺傳毒性;與ANE相反,即使在S9液活化的前提下,檳榔多酚對鼠傷寒沙門菌TA100菌株亦無致突變性,甚至在Ames試驗中還體現(xiàn)出抗突變性。Jeng等發(fā)現(xiàn),檳榔中的兒茶精以劑量-依賴方式引起培養(yǎng)的口腔黏膜成纖維細胞死亡并減少增殖。Wang等發(fā)現(xiàn),檳榔中的兒茶精五倍體到十倍體的低聚原花青素通過消耗胞內硫醇誘導脾淋巴程序性細胞死亡,而單體到四倍體則無活性。例如用N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)預處理,上述效應可明顯減弱。2.3生物活性有作者采用涂抹和放置可替換的膠囊等方法使倉鼠頰囊暴露于檳榔多酚,6~12個月、13~24個月分別處死倉鼠,可見大塊的不典型損害、癌前損害和癌瘤等口腔黏膜損害,其發(fā)生率較暴露于ANE要高2.5倍,說明含鞣質的檳榔多酚是檳榔的主要致癌成分。有研究提及鞣質的自動氧化過程可產(chǎn)生ROS,但也有捕獲亞硝酸鹽和ROS的可能。在其他研究領域中,水解型鞣質公認具有致癌性,而提取自葡萄和蘋果等植物的縮合型鞣質(原花青素)因為具有抗氧化和抗炎活性,可誘導腫瘤程序性細胞死亡,被認為具有抗癌性和抗突變性。檳榔中所含原花青素的分布和葡萄籽十分相似,其抗氧化性已被證實,且隨兒茶精聚合度的增加而增加,其還可調控環(huán)氧化酶-2表達并具有抗炎活性。不過令人感到疑惑的是,另一方面檳榔原花青素又可誘導細胞毒性和淋巴程序性細胞死亡。有關這些檳榔鞣質的生物活性互相矛盾的報道,筆者認為與3點因素有關。一是很多研究涉及的是檳榔鞣質混合物,其所含水解型和縮合型鞣質的生物活性差異較大且相互干擾;二是不同研究試驗條件的差異也許只能部分解釋這些現(xiàn)象;三是檳榔鞣質尤其是縮合型鞣質也許的確存在兩重性。3關于檳榔的特異性亞硝酸鹽3.1腈、3-methyl-nitrosaminoASNA主要由ARC和檳榔次堿在口腔內亞硝化形成。至今有4種ASNA自檳榔咀嚼者的唾液中分離出來,包括3-甲基亞硝氨基丙腈(3-methyl-nitrosaminopropionitrile,MNPN)、3-甲基亞硝氨基丙醛(3-methyl-nitrosaminopropionaldehyde,MNPA)、N-亞硝基四氫煙酸(N-nitrosoguvacine,NGC)、N-亞硝基四氫煙酸甲酯(N-nitrosoguva-coline,NG),其中NG含量最高。3.2基于ames試驗結果從遺傳毒性來看,MNPA的遺傳毒性和致突變性最強,NGC的遺傳毒性和致突變性最弱。MNPA可誘發(fā)所培養(yǎng)的人頰黏膜角質形成細胞DNA鏈斷裂和DNA蛋白交聯(lián),而MNPN、NG和NGC均無此效應。Ames試驗顯示,MNPA在細胞色素P450同工酶催化下誘發(fā)鼠傷寒沙門菌YG710菌株突變的最低底物濃度為1mmol·L-1,MNPN則為100mmol·L-1,NG的遺傳毒性則較前兩者要低很多,而NGC對鼠傷寒沙門菌TA1535菌株無遺傳毒性。Thongsuksai等通過分析單純咀嚼檳榔所致的口腔鱗癌樣本并與單純吸煙和飲酒等導致口腔鱗癌樣本進行對比發(fā)現(xiàn),前者有約11.8%p53基因突變,突變率和突變類型較后者有較大差別。這種突變是由ASNA引起的。3.3asna促進k-ras突變哺乳動物致癌試驗結果顯示,MNPN為強致癌劑,可誘發(fā)試驗動物口腔腫瘤,但其主要靶器官為鼻腔和食管。有人給予F334鼠皮下注射MNPN,24周后所有試驗動物均被誘發(fā)腫瘤,主要位于食管(87%)和鼻腔(70%),舌(37%),咽部也有少許累及。ASNA之所以具有遺傳毒性和致癌性,緣于其可引起DNA甲基化,生成DNA加合物。Bhattacharjee等發(fā)現(xiàn),ASNA可誘導大腸桿菌生成pMTa4DNA加合物,且在正常代謝條件下胞內鈉或鉀離子濃度足以維持其穩(wěn)定性,而只有穩(wěn)定的DNA加合物方能誘導和維持致突變性,引起基因突變誘發(fā)腫瘤。Lin等發(fā)現(xiàn),取自檳榔咀嚼者的舌鱗狀細胞癌樣本中,有54%的可觀察到p16/MTSI啟動子區(qū)的甲基化。直接分析口腔癌組織中的DNA甲基化類型,可能進一步闡明ASNA在口腔癌發(fā)生中的作用。有人發(fā)現(xiàn):細胞色素P450的幾種同工酶,尤其是CYP2A亞科成員系亞硝胺的主要代謝激活酶,可催化亞硝胺導致基因突變;其中,CYP2A6是MNPN的最強激活酶,CYP1A1和CYP1B1次之;CYP2A13對MNPA催化作用最強,CYP2A6、CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1作用較弱;CYP2A13和CYP2A6則對NG有效。4ros生成ROS是指以超氧陰離子和羥自由基為代表的氧自由基和易形成自由基的過氧化物的總稱,大量的ROS通過造成DNA氧化性損傷和激活癌基因的方式促使癌癥的發(fā)生。檳榔咀嚼過程中可產(chǎn)生ROS,至于何種檳榔的具體成分促使ROS生成以及鞣質的作用尚不明確,而ARC則基本得到確認;體外試驗證明,人角質形成細胞株HaCaT在內的多種細胞經(jīng)ARC處理后,ROS生成增加。此外,堿性條件(檳榔嚼塊中加入石灰)和過渡銅鐵金屬離子為ROS釋放的促進因素。4.1ros的滲透作用ROS對口腔黏膜的多種有害效應分別為:1)ROS具有遺傳毒性和致突變性,直接涉及腫瘤的起始過程;2)ROS能攻擊涎腺蛋白質和口腔黏膜,引起口腔黏膜結構變化,導致其他檳榔嚼塊成分和環(huán)境毒物的滲透更為容易;3)檳榔咀嚼者口腔黏膜內的炎癥細胞可釋放ROS,導致鄰近細胞的基因突變并促進腫瘤形成。4.2ros對小鼠骨髓細胞的氧合酶原激活劑作用ROS除自身所具有的毒性外,ROS還通過氧化性應激參與或者部分介導ARC和ANE的多種毒性效應。有研究顯示,ARC抑制AMPK活性,而誘導程序性細胞死亡的效應必須通過ROS方能實現(xiàn),抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)和NAC可降低這一效應。Lin等用ANE處理中國倉鼠卵細胞后發(fā)現(xiàn),胞內ROS水平上升,同時微核率、原漿移動失敗和非整倍體細胞明顯增加,但可被過氧化氫酶抑制,說明上述遺傳毒性與ROS引起的氧化性應激有關。Lai等將HaCaT細胞暴露于20mg·L-1亞致死量的ANE中,傳35代后次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶位點突變和微核率明顯增加,且伴隨胞內ROS和8-羥基脫氧鳥苷水平上升,說明HaCaT細胞長時間暴露于ANE,可導致其氧化性損傷及基因損害。隨著內源性GSH的消耗,ANE對小鼠骨髓細胞和人外周血淋巴細胞的遺傳毒性會增強;如用超氧化物歧化酶處理或者在低氧條件下,染色體畸變率會下降,說明ROS至少是導致檳榔遺傳毒性的部分原因。ROS還與檳榔的免疫抑制效應有關,而免疫功能惡化是發(fā)生腫瘤最關鍵的內因。ANE可抑制脾T細胞活化以及IL-2和γ-干擾素的生成,同時胞內ROS水平增加,而這些效應均可被抗氧化劑NAC減輕,說明此免疫抑制效應至少部分是通過氧化性應激介導的。ANE可誘導外周血單核細胞TNF-α以及IL-1和IL-6等炎癥細胞因子表達增加,從而增加局部炎癥反應和改變免疫功能;而此效應可被抗氧化劑姜黃素所抑制,說明氧化性應激可能涉及與ANE相關的免疫改變。在相對分子質量3.0×104~10.0×104的ANE組分中新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白聚糖,可以通過增加胞內ROS水平及一系列信號級聯(lián)放大,上調口腔癌細胞低氧誘導因子-1α的表達,最終誘導細胞自噬。因為該蛋白聚糖誘導的細胞自噬較ARC誘導的程序性細胞死亡占優(yōu)勢,故包含此兩種物質的ANE整體上仍表現(xiàn)為誘導細胞自噬,這有利于保護癌細胞免遭ARC誘導的程序性細胞死亡,可能促進口腔癌的發(fā)展。此外,ANE還可能通過ROS促進舌癌轉移。腫瘤細胞刺激血小板聚集是其轉移的機制之一,ANE可增強舌鱗狀上皮細胞癌細胞株刺激血小板聚集的效應,ROS清除劑過氧化氫酶可抑制這種作用。5e組分中ane的誘導本文旨在總結檳榔具體成分和代謝產(chǎn)物的致癌作用和機制,并沒有將涉及所有檳榔成分的ANE研究單獨列出,因為無法驗證其毒性由哪些具體成分負責。不過檳榔單一成分和ANE的比較研究可以了解其毒性的差異,為其研究提供新的方向和思路,相對分子質量3.0×104~10.0×104的ANE組分中可誘導細胞自噬的蛋白聚糖就是這樣被發(fā)現(xiàn)的。值得關注的是,ARC和鞣質與腫瘤的關系在某些方面體現(xiàn)出一定二重性。譬如,ARC一方面誘導健康細胞程序性死亡,是OSF的發(fā)病機制之一;另一方面又可誘導口腔癌細胞程序性死亡,抑制癌細胞的生長。檳榔水解型鞣質有致