表達載體的構建方法及其步驟

現(xiàn)在，載體重要有病毒和非病毒兩大類,其中質粒DNA是一種新的非病毒轉基復制起始位點Ori即控制復制起始的位點。原核生物DNA分子中只有真核生物DNA分子有多個復制起始位點?？股乜剐曰蚰軌虮阌诩右詸z測，如Amp+多克隆位點MCS克隆攜帶外源基因片段P/E啟動子/增強子Terms終止信號加poly（A）信號能夠起到穩(wěn)定mRNA作用載體選擇重要考慮下述3點：【1】構建DNA重組體的目的，克隆擴增/基因體現(xiàn)，選擇適宜的克隆載體/體克隆載體的克隆能力－據克隆片段大?。ù筮x大，小選?。?。如體現(xiàn)載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/4【3】載體MCS中的酶切位點數與構成方向因載體不同而異，適應目的基因與總而言之，選用質粒（最慣用）5體普通使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，普通10嚴謹型質粒<10個。必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一需要加入標簽蛋白，與否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。DNA進行切割，獲得線性載體分子，方便于與目的基因片段進行連接。第一步：首先看Ori的位置，理解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒Ampr水解β－tetr能夠制止四環(huán)素進入細胞。camrneor（kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶使G418（長那霉素衍生物）hygr使潮霉素β第四步：再看外源DNA10Kb的外源DNA片段。普通來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化啟動子－增進DNA轉錄的DNA序列，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是DNA分子上能夠與RNApol特異性結合并使之開核糖體結合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。有一種AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富2部分共同構成poly（A）加尾信號。構造基因的最后一種外顯子中有一種AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條DNA鏈，即DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.根據體現(xiàn)宿主不同，構建時所選擇的載體也會不同。cDNAPCR試劑名 生產廠載體 大腸桿菌菌株 限制性內切 T4連接 DNA凝膠回收試劑 瓊脂 DNA （2）XXTransheepPUC57PUC57-X基因EcoRI/BamHI酶切成果：2.載體用pCDNA3.120ul酶切體系3734ulpCDNA3.1（500ng/ul）1ulBamHI1ul2ul10×buffer12ulH2O酶切完畢后膠回收（見附錄6ulPCR酶切回收片段（約50ng/ul）1ul酶切好的載體（約50ng/ul）2ulligasebuffer1ulT4ligase10ul