線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征的先證者rna基因多態(tài)性

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征的先證者rna基因多態(tài)性

中風(fēng)病的特點(diǎn)是高真空血癥和假單胞菌。這是一種高度異質(zhì)的臨床和基因性x線病，通常伴有多個(gè)器官。最常見的是神經(jīng)系統(tǒng)、骨瘦如神經(jīng)。t3243g位點(diǎn)約為80%。然而A3243G突變存在很大的臨床異質(zhì)性,使得攜帶同一個(gè)突變的個(gè)體呈現(xiàn)不同類型、不同程度的臨床表型,有些甚至終身不發(fā)病。導(dǎo)致這種臨床異質(zhì)性的原因除了突變比例和組織分布的不同外,目前已報(bào)道有40余個(gè)mtDNA多態(tài)性位點(diǎn)也與MELAS表型有關(guān),并且也有MELAS患者未攜帶A3243G的報(bào)道。本文對(duì)6個(gè)MELAS家系的先證者進(jìn)行了臨床病理分析,并進(jìn)行mtDNA全序列分析,探討基因突變異質(zhì)性及mtDNA多態(tài)性對(duì)患者表型的影響。1對(duì)象和方法1.1先證者家系培養(yǎng)6例臨床診斷為MELAS的先證者(所屬家系分別為HM1、HM2、HM3、HM4、HM5和HM6)和12例先證者家系母系成員(圖1)皆來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,研究內(nèi)容和方法經(jīng)浙江大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并簽署了知情同意書。所有先證者均進(jìn)行血乳酸、神經(jīng)電生理、頭顱MRI和肌肉活檢病理等檢測(cè)。對(duì)家系成員的個(gè)人資料、親屬關(guān)系、家族史進(jìn)行了詳細(xì)的調(diào)查,并進(jìn)行體格檢查,以確定是否具有相關(guān)的臨床表現(xiàn)。1.2方法1.2.1低場核磁共振波譜分析對(duì)6例先證者在發(fā)病的急性期進(jìn)行頭顱MRI檢查,包括T1加權(quán)、T2加權(quán)、擴(kuò)散加權(quán)成像(DWI),其中3例做了磁共振波譜分析(MRS)。肌肉病理:肌肉活檢標(biāo)本冰凍切片常規(guī)進(jìn)行蘇木精-伊紅、改良Gomori三色、琥珀酸脫氫酶(SDH)及細(xì)胞色素c氧化酶(COX)染色等系列酶組織化學(xué)染色和透射電鏡檢測(cè)。1.2.2檢測(cè)測(cè)序方法抽取家系每個(gè)成員的外周血3mL,苯酚-氯仿抽提法分離外周血全基因組DNA,-20℃保存?zhèn)溆?選取正常人DNA作為對(duì)照組。PCR擴(kuò)增先證者家系若干母系成員及對(duì)照組的線粒體tRNALeu(UUR)基因,正向引物5′-TCAACAATAGGGTTTACGAC-3′(mtDNA-2966-2985),反向引物5′-AGGAATGCCATTGCGA-TTAG-3′(mtDNA3346-3365),擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ApaⅠ消化,3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。野生型為400bp單一條帶,突變型的400bp將被切成281bp和119bp兩個(gè)片段。為進(jìn)一步驗(yàn)證A3243G異質(zhì)性程度與MELAS臨床表型及嚴(yán)重程度的相關(guān)性,采用焦磷酸測(cè)序法(BGI華大基因)精確測(cè)定A/G的突變比例。線粒體基因全序列測(cè)定:使用24對(duì)具有部分片段重疊的引物,對(duì)先證者線粒體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序,應(yīng)用SeqManII序列比對(duì)軟件與修正后的人類線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)拼接,峰圖查看分析軟件為Chromas軟件。為比較rRNA和編碼區(qū)位點(diǎn)在進(jìn)化上的保守性,查找人(NC_011137)、牛(HM045018.1)、鼠(NC_006914.1)、爪蟾(NC_001573.1)等4個(gè)物種的DNA及蛋白序列,采用BioEdit軟件進(jìn)行保守性分析。為探究多態(tài)性位點(diǎn)相關(guān)表型對(duì)MELAS癥狀的修飾作用,根據(jù)線粒體全基因組測(cè)序情況采用Mitotool軟件測(cè)定6例先證者的單倍型,并收集已報(bào)道的與線粒體病表型相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn),比較6例先證者多態(tài)性位點(diǎn)與表型的相關(guān)性。對(duì)于血液中突變檢測(cè)為陰性的患者,提取其肌肉組織DNA進(jìn)行Sanger測(cè)序,以確認(rèn)A3243G位點(diǎn)或其他可疑位點(diǎn)的致病性突變。1.2.3polg1基因測(cè)序POLG1和SURF1基因是與MELAS和Leigh綜合征相關(guān)的常見核基因。本研究擴(kuò)增了兩例A3243G為陰性的MELAS/Leigh疊加綜合征患者POLG1基因位于exon2的CAG重復(fù)序列,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行直接測(cè)序;并對(duì)exon7、exon13、exon16、exon21區(qū)域進(jìn)行了點(diǎn)突變檢測(cè)。對(duì)SURF1基因進(jìn)行了全基因測(cè)序。2結(jié)果與分析2.1患者mrs及hm3的異常表現(xiàn)6例MELAS家系先證者臨床資料顯示(表1),先證者始發(fā)病年齡從13歲~36歲不等,臨床表現(xiàn)均有反復(fù)的抽搐、腦卒中樣發(fā)作和高乳酸血癥等MELAS綜合征典型癥狀;身材矮小、耳聾、認(rèn)知退行、運(yùn)動(dòng)不耐受等常見伴發(fā)癥狀;本研究提示呼吸衰竭、消化道功能障礙、皮膚黑等癥狀也應(yīng)值得關(guān)注。6例先證者影像學(xué)(圖2A)均有典型的顳/頂枕大片異常信號(hào),符合MELAS表現(xiàn),3例先證者M(jìn)RS有典型的乳酸波。2例(HM3和HM5)同時(shí)有中腦小腦異常信號(hào),符合MELAS/Leigh重疊綜合征表現(xiàn),這2例先證者的復(fù)發(fā)次數(shù)明顯多于其他4位先證者,其中HM3于發(fā)病后20個(gè)月死亡。肌肉活檢(圖2B)結(jié)果顯示除HM5外,其他5例先證者肌肉中均見到破碎紅纖維(Raggedredfibers,RRF)、線粒體數(shù)目和形態(tài)異常。血液乳酸含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),6例先證者中HM3的LAC含量最高(18mmol/L),HM6的LAC含量最低(3.1mmol/L),均高于正常人群(正常人<2mmol/L)。結(jié)合6例先證者的家系圖(圖1),家族史中耳聾、糖尿病、流產(chǎn)史為常見的異常,其中HM1的母親有偏頭痛、糖尿病、流產(chǎn)史和卒中樣發(fā)作1次,為臨床發(fā)病者;胞弟有生長發(fā)育遲滯,父親有糖尿病,為高度異常家族史。HM2母親、姨媽和其3個(gè)子女患有糖尿病。HM3無異常家族史,HM4母親有流產(chǎn)史,HM5和HM6母親均有耳聾表現(xiàn)。2.2干預(yù)軸組的突變分析2.2.1ga3g陽性突變與酶切鑒定對(duì)6例先證者的tRNALeu(UUR)基因進(jìn)行了Sanger測(cè)序。結(jié)果顯示,4例先證者存在A3243G異質(zhì)性突變且雜合峰高不同(圖3A)。進(jìn)一步對(duì)A3243G陽性先證者12位母系成員的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用ApaⅠ酶切鑒定,發(fā)現(xiàn)只有HM1的母親(HM1-Ⅱ-4)和胞弟(HM1-Ⅲ-1)以及HM6的母親(HM6-Ⅰ-1)存在A3243G異質(zhì)性突變(圖3B),而HM2家系的母系成員Ⅱ-5、Ⅲ-10、Ⅲ-12、Ⅳ-2和HM4家系的母系成員Ⅰ-2、Ⅱ-3、Ⅲ-4中未檢測(cè)到A3243G突變(數(shù)據(jù)未顯示)。酶切結(jié)果顯示(圖3B):HM1和HM6先證者281bp突變條帶亮度明顯高于HM2和HM4先證者。HM1和HM6先證者281bp條帶亮度也高于其家系成員HM1-Ⅱ-4、HM1-Ⅲ-1和HM6-Ⅰ-1。為驗(yàn)證異質(zhì)性存在的差異,對(duì)A3243G陽性突變的先證者進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,結(jié)果顯示異質(zhì)性程度與酶切結(jié)果一致(圖3C):HM1和HM6的異質(zhì)性比例較高(圖3C),達(dá)到53%和59%;而HM2和HM4的異質(zhì)性分別為29%和30%。2.2.2mela/legh疊加綜合征先證者HM3和HM5未檢測(cè)到A3243G位點(diǎn)突變,也未發(fā)現(xiàn)與MELAS相關(guān)的C3256T、T3271C和T3291C等典型位點(diǎn)突變。但在HM3-Ⅱ-1血液中發(fā)現(xiàn)了T13094C突變,進(jìn)一步檢測(cè)其肌肉發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變?cè)诩∪庵械谋壤咏?00%(圖4)。對(duì)HM3的2位母系成員(Ⅰ-1、Ⅱ-3)的檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)T13094C突變。已有報(bào)道T13094C突變可以導(dǎo)致MELAS/Leigh疊加綜合征。在HM5患者中檢測(cè)到ND4基因A11084G同質(zhì)性突變,該突變同時(shí)又是線粒體單體型A15a的多態(tài)位點(diǎn),尚未見單獨(dú)致病的報(bào)道。同時(shí),本研究分析了HM3和HM5患者mtDNA中多態(tài)性位點(diǎn)。如表2所示,HM3和HM5中共有24個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與線粒體疾病相關(guān),其中HM3患者中有16個(gè)位點(diǎn)與MELAS相關(guān),HM5中有10個(gè)位點(diǎn)與MELAS相關(guān),同時(shí)與MELAS和Leigh綜合征相關(guān)的位點(diǎn)有9個(gè):D-Loop區(qū)A73G和A263G;12SrRNAA750G;16SrRNAA2706G;ATP6A8701G;ND4G11719A;ND5C12705T和T13094C;CytbA15326G。2.2.3先證者土地多態(tài)性位點(diǎn)t293的單倍體型分析及與表型相關(guān)分析6例先證者共檢測(cè)到已報(bào)道的多態(tài)性位點(diǎn)如下:D-loop區(qū)有13個(gè);12SrRNA有6個(gè);16SrRNA有3個(gè);tRNALeu(UUR)基因有1個(gè);在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域存在10個(gè)已知的同義突變和22個(gè)已知的錯(cuò)義突變。這些錯(cuò)義突變包括:位于ND1的C3497T(A64V)、C3571T(L89F)、G4048A(D248N)、ND2A4824G(T119A)、C5178A(L237M);CO2的A8108G(I175V);ATP8的C8414T(L17F)、A8459G(N32D);ATP6的G8584A(A20T)、T8618C(I31T)、A8701G(T59A)、C8794T(H90Y)、A8860G(T112A);ND3的A10398G(T114A);ND4的A11084G(T109A)、G11969A(A404T);ND5的T13094C(V253A);ND6的T14318C(N119S)、C14340T(V112M);Cytb的C14766T(T7I)、T14979C(I78T)和A15326G(T194A)。這些突變的意義有待進(jìn)一步研究。根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)的單倍體型分析,6例先證者的線粒體單倍體分別是:C5a1(HM1)、D4a(HM2和HM6)、M11(HM3)、B4c1(HM4)和A15a(HM5)。MELAS患者往往是多器官受累,本研究對(duì)先證者線粒體基因組全序分析顯示:無論是3243A>G突變陽性還是陰性患者,均存在多個(gè)與表型相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。這些突變位點(diǎn)大多與MELAS、LHON、糖尿病、耳聾、偏頭痛、心臟病、癲癇等癥狀相關(guān)。如D-Loop區(qū)域中,T146C與耳聾、LHON、線粒體肌病相關(guān),C16278T與LHON、耳聾、代謝綜合征、線粒體腦肌病相關(guān);位于16SrRNA的G3010A和D-Loop的T16519C可促進(jìn)伴隨偏頭痛的周期性嘔吐綜合征的發(fā)生;位于ND1區(qū)域的C3497T和位于ND4區(qū)域G11914A均與LHON表型相關(guān)。多態(tài)性位點(diǎn)T1095C、A8108G、T9950C、C14340T不僅與HM3先證者單倍體型位點(diǎn)組成相關(guān),也與耳聾、LHON表型相關(guān);同義突變位點(diǎn)A750G、A1438G和A4769G與癲癇相關(guān);同義突變位點(diǎn)G11719A和C12705T還與呼吸功能衰竭相關(guān)。2.3測(cè)序分析比對(duì)對(duì)HM3-Ⅱ-1和HM5-Ⅱ-3患者的POLG1基因進(jìn)行外顯子2、7、13、16和21的PCR擴(kuò)增,未找到與MELAS相關(guān)的典型突變位點(diǎn),對(duì)SURF1基因測(cè)序分析比對(duì)也未發(fā)現(xiàn)致病性突變位點(diǎn)(exon1和2)。3trna的基因文化線粒體疾病是由于基因突變引起的、線粒體氧化磷酸化功能異常為特征的、多系統(tǒng)受累的疾病,無論是基因型還是臨床表型均具有高度異質(zhì)性。本研究探討了6個(gè)MELAS家系先證者的臨床表現(xiàn)和分子遺傳學(xué)特征。家系中的先證者均表現(xiàn)出典型的MELAS臨床癥狀,如頭暈嘔吐、精神異常、癲癇發(fā)作、認(rèn)知退化、消瘦、身材矮小等;除HM3和HM4家系成員無臨床表現(xiàn)外,其他家系中的母系成員表現(xiàn)出了糖尿病、耳聾等癥狀,其中HM1先證者的母親現(xiàn)在也是MELAS患者。對(duì)先證者母系成員進(jìn)行A3243G突變檢測(cè),發(fā)現(xiàn)HM1家系的Ⅱ-4、Ⅲ-1和HM6家系中的Ⅰ-1攜帶該突變,而HM2家系母系成員Ⅱ-5、Ⅲ-10、Ⅲ-12、Ⅳ-2和HM4家系的母系成員(Ⅰ-2、Ⅱ-3、Ⅲ-4)中未檢測(cè)到A3243G突變,這與國外報(bào)道的母系遺傳方式不相符。這一方面與突變比例低、檢測(cè)靈敏度的限制有關(guān),另一方面提示A3243G也存在新生突變,即在卵細(xì)胞生成或者受精時(shí)期的自發(fā)突變。tRNALeu(UUR)A3243G突變的雜合度往往與表型相關(guān),但也有研究報(bào)道血液中雜合度與疾病嚴(yán)重程度并無明確的相關(guān)性。A3243G突變與tRNALeu(UUR)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、氨酰化修飾、密碼子的識(shí)別等有關(guān)。該突變影響tRNA的合成并導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄剪切的終止,進(jìn)一步使復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ功能缺陷,從而導(dǎo)致ATP合成受阻,器官供能不足,導(dǎo)致臨床癥狀的產(chǎn)生。Lu等研究提示當(dāng)細(xì)胞中A3243G的雜合度超過70%不會(huì)引起糖尿病,而會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的癥狀,如身材矮小、原發(fā)性心肌病等;而當(dāng)血液中雜合度在10%~30%時(shí)可能只引起糖尿病、耳聾等癥狀。本研究結(jié)果顯示(圖2A),陽性個(gè)體中HM1和HM6的雜合比例較高,HM2和HM4的雜合比例較低,除了HM4沒有糖尿病或耳聾,HM1和HM2均有糖尿病,HM6有耳聾癥狀。Qi等在57例A3243G突變的中國線粒體腦肌病患者中發(fā)現(xiàn)A3243G異質(zhì)性與表型的嚴(yán)重程度無關(guān),但與發(fā)病年齡相關(guān)。Vivero等則認(rèn)為A3243G異質(zhì)性程度越高,耳聾表型就越嚴(yán)重,同時(shí)Ma等在47例中國患者中探究到該異質(zhì)性突變與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究中HM1和HM6兩者異質(zhì)性程度最高,典型的MELAS臨床表現(xiàn)也較為嚴(yán)重,HM1的突變異質(zhì)性高于其母親Ⅱ-4,發(fā)病年齡也早于其母親;HM6的母親攜帶突變比例較低未發(fā)病,故本研究中的4例A3243G陽性患者表型嚴(yán)重程度與該位點(diǎn)異質(zhì)性程度大致呈正相關(guān)。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn)突變的異質(zhì)性程度越高,陽性家族史越突出,如HM1家族中檢出2例A3243G突變者,其母親又是臨床發(fā)病者。HM3和HM5雖然未檢測(cè)到A3243G突變,但都具有典型的反復(fù)中風(fēng)樣發(fā)作、高乳酸血癥、乳酸波等特征,MRI病變同時(shí)累及腦干和小腦符合MELAS/Leigh重疊綜合征的影像學(xué)表現(xiàn)。本研究在HM3患者血液中檢測(cè)到低比例的T13094C異質(zhì)性突變,但肌肉組織中突變比率接近100%,已有研究報(bào)道該突變可以導(dǎo)致MELAS/Leigh疊加綜合征、小腦性共濟(jì)失調(diào)等表型,如此高的突變比例可以部分解釋HM3患者頻繁發(fā)作的代謝危象、日益惡化的腦功能乃至20個(gè)月內(nèi)死亡的病程。線粒體多態(tài)位點(diǎn)