丙泊酚對新生小鼠大腦梨狀皮層中間神經(jīng)元的影響及相關作用研究

丙泊酚對新生小鼠大腦梨狀皮層中間神經(jīng)元的影響及相關作用研究研究背景:丙泊酚(Propofol)是一種短效的、新型快速的全身麻醉藥物,因其起效迅速、作用時間短、蘇醒快、術后惡心嘔吐發(fā)生率低而被廣泛應用于臨床麻醉及ICU鎮(zhèn)靜。近年來,麻醉藥物對發(fā)育大腦認知、學習記憶的影響是大家關注的熱點問題。臨床研究結果表明,兩歲以下嬰幼兒全麻藥物暴露可致較長時間的人格及行為改變。然而,全麻藥物丙泊酚所致神經(jīng)毒性的機制仍不明確。大腦梨狀皮層(Piriformcortex)位于前腦腹外側,源于古皮質,屬邊緣系統(tǒng),是哺乳動物最大的嗅覺皮層,接受嗅球的單突觸輸入,且與相關皮層及海馬間存在復雜的纖維投射。梨狀皮層由三層皮質組成,第一層稱為網(wǎng)織層,主要接受外側嗅束的投射纖維,第二、三層稱為細胞層,主要接收外側嗅束、相鄰皮層的興奮輸入及局部中間神經(jīng)元的抑制傳入。發(fā)育期大腦梨狀皮層神經(jīng)前體細胞具有增殖及分化發(fā)育為成熟神經(jīng)元的能力,該皮層同海馬及室管膜下區(qū)一樣存在神經(jīng)發(fā)生的潛能。此外,梨狀皮層的細胞層主要由數(shù)量較多的釋放谷氨酸的椎體神經(jīng)元及數(shù)量較少釋放γ-氨基丁酸的中間神經(jīng)元組成。梨狀皮層的中間神經(jīng)元按其細胞表面標記物主要分為鈣結合蛋白(PV—Parvalbumin、CB—Calbindin、CR—Calretinin)中間神經(jīng)元和神經(jīng)肽(SOM—Somatostatin、NPY—NeuropeptideY、CCK—Cholecystokinin)中間神經(jīng)元兩大類。該皮層內上述中間神經(jīng)元的功能頗為復雜,涉及樹突的傳入、軸突的輸出以及各中間神經(jīng)元的遠程聯(lián)接。正是因為對信息傳入、輸出的調控,該區(qū)域內的中間神經(jīng)元在嗅覺的學習、記憶過程中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn),對阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)患者而言,其嗅覺損害癥狀早于認知障礙的發(fā)生,并且其大腦梨狀皮層SOM及CR中間神經(jīng)元與AD病理性標記物β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ,Aβ)及Tau蛋白之間存在共同標記,這提示梨狀皮層中間神經(jīng)元在AD的發(fā)生及發(fā)展中的易損性及其與認知障礙的密切相關性。此外,多項研究證實,尿烷(Urethane)麻醉可導致大腦梨狀皮層選擇性的中間神經(jīng)元損傷,這可能與麻醉所致的認知功能損害相關。換而言之,梨狀皮層可能是麻醉藥物發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用新的靶區(qū)。神經(jīng)行為障礙(neurobehavioraldisorders)是由多種與大腦疾病或損傷相關聯(lián)的行為功能損害組成。神經(jīng)行為學(neuroethology)則是對動物的行為及神經(jīng)系統(tǒng)機制研究的方法,目的是通過動物的特殊行為學改變了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,cns)病變。既往研究表明,新生期吸入麻醉藥七氟烷暴露不僅引發(fā)學習認知功能受損,還可導致類似自閉癥樣的社交行為學異常。結合本課題組前期研究成果:丙泊酚抑制發(fā)育大腦海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的增殖,進一步探究丙泊酚對認知相關行為的影響及其可能的機制。研究方法:本課題首先采用出生后7天(postnatal7,p7)的新生小鼠進行丙泊酚(30mg/kg組及60mg/kg組)或脂肪乳腹腔注射以建立丙泊酚模型,應用c-fos免疫組織化學染色方法篩選丙泊酚對發(fā)育大腦的激活靶區(qū)及定性該靶區(qū)內易損神經(jīng)元的類別;同樣地,采用免疫組織化學方法檢測丙泊酚激活區(qū)域(梨狀皮層)神經(jīng)前體細胞增殖以明確丙泊酚對發(fā)育大腦梨狀皮層神經(jīng)發(fā)生的影響。此外,建立丙泊酚多次注射模型,即p7-p9連續(xù)注射丙泊酚并飼養(yǎng)至成年以觀察發(fā)育期丙泊酚暴露對遠期神經(jīng)行為的影響。采用食物埋藏實驗(buriedfoodtest)檢測丙泊酚模型小鼠與對照組小鼠的嗅覺識別及嗅覺學習記憶功能;采用社交實驗(sociabilityandpreferencefornoveltytest)檢測丙泊酚模型小鼠與對照組小鼠的社會行為及社會偏好;采用新物體識別實驗(novelobjectrecognitiontest)檢測丙泊酚模型小鼠與對照組小鼠的認知記憶功能。最后,應用免疫組織化學方法檢測p21小鼠大腦梨狀皮層易損神經(jīng)元的改變以探討丙泊酚影響發(fā)育大腦神經(jīng)行為可能的機制。研究結果:1、丙泊酚激活發(fā)育大腦梨狀皮層中間神經(jīng)元(1)c-fos免疫組織化學結果表明:與脂肪乳對照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組(p<0.05)及丙泊酚60mg/kg組(p<0.05)小鼠大腦梨狀皮層c-fos+細胞均顯著增多。(2)c-fos與neun及gfap雙重標記免疫組織化學結果表明:三組間,neun標記的成熟神經(jīng)元數(shù)量無差異;丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組與脂肪乳對照組相比c-fos與neun雙重標記陽性細胞數(shù)量均顯著增多(p<0.05);然而,c-fos與gfap無共標陽性細胞。(3)c-fos與cb、cr、som、npy雙重標記免疫組織化學結果表明:丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組與脂肪乳對照組相比c-fos與cb雙重標記陽性細胞數(shù)量均顯著增多(p<0.01);然而,c-fos與cr中神經(jīng)元及神經(jīng)肽類中間神經(jīng)元標記物som、npy之間幾乎沒有共標陽性細胞。2、丙泊酚對發(fā)育大腦梨狀皮層神經(jīng)前體細胞增殖的影響(1)brdu免疫組織化學結果表明:與脂肪乳對照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組(p<0.05)及丙泊酚60mg/kg組(p<0.01)小鼠大腦梨狀皮層brdu+細胞均顯著減少;且與丙泊酚30mg/kg組相比,丙泊酚60mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層brdu+細胞減少更為顯著(p<0.05)。(2)sox2與brdu雙重標記免疫組織化學結果表明:與脂肪乳對照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層sox2+細胞無顯著差異,丙泊酚60mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層sox2+細胞則減少顯著(p<0.01)。同樣地,brdu-sox2雙標陽性細胞數(shù)量丙泊酚30mg/kg組與脂肪乳對照組相比,改變無顯著差異,而丙泊酚60mg/kg組則顯著減少(p<0.01)。(3)nestin免疫組織化學結果表明:與脂肪乳對照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層nestin標記神經(jīng)干細胞纖維突起分布稀疏且排列紊亂(p<0.01)。3、發(fā)育期丙泊酚麻醉暴露對成年期神經(jīng)行為學的影響及可能機制(1)食物埋藏實驗結果表明:丙泊酚30mg/kg組小鼠與對照組小鼠相比探索埋藏食物的潛伏期無明顯改變,然而丙泊酚60mg/kg組小鼠與對照組及丙泊酚30mg/kg組小鼠相比,探索埋藏食物的潛伏期則明顯增加(p<0.01,p<0.05)。(2)社交實驗結果表明:對照組小鼠較喜歡呆在有小鼠的一側箱體(p<0.05),而丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠在兩側箱體的時間則無差異;在該實驗的第二階段即社會新奇偏好性測試中,對照組小鼠較偏好與陌生小鼠交流(p<0.01),而丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠則未有如此表現(xiàn)。(3)新物體識別實驗結果表明:對照組小鼠新物體的探索時間較舊物體探索時間明顯增多(p<0.001),而丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠則無明顯偏好性。換言之,丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠較對照組小鼠新物體分辨率明顯下降(p<0.001)。(4)p21小鼠大腦切片免