實驗三-血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

實驗三血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳分析技術(shù)是目前臨床常規(guī)測定中應(yīng)用最廣的方法，具有微量、快速、簡便、吸附作用和電滲作用小、分離區(qū)帶清晰、靈敏度及分辨率高等特點。醋酸纖維素薄膜還可進行透明化處理，便于照相和掃描計算結(jié)果。廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結(jié)合球蛋白、同工酶的分離和測定。【目的】1.掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理、操作方法。2.了解電泳法分離蛋白質(zhì)的臨床意義。【原理】帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極泳動的現(xiàn)象稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點大多在pH4.0～7.3之間，在pH8.6的緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中都向正極移動。由于血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，因此在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少不同，又由于其分子大小不同，所以在電場中泳動速度也不同。分子小而帶電荷多者，泳動速度較快；反之，則泳動速度較慢。因此通過電泳可將血清蛋白質(zhì)分為5條區(qū)帶，從正極端依次分為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白等，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)?！酒鞑摹看姿崂w維素薄膜（2cm×8cm）、培養(yǎng)皿、濾紙、無齒鑷、剪子、加樣器（可用蓋玻片或或微量加樣器）、直尺、鉛筆、玻璃板（8cm×12cm）、試管、試管架、吸管、電泳儀、電泳槽、分光光度計或吸光度掃描計?！驹噭?.巴比妥緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06)稱取巴比妥鈉12.76g、巴比妥1.66g，加500毫升蒸餾水，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水至1000毫升。2.氨基黑10B染色液稱取氨基黑10B0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混勻，加蒸餾水至100ml。3.漂洗液甲醇45ml、冰醋酸5ml，混勻后加蒸餾水至100ml。4.洗脫液0.4mol／LNaOH溶液。5.透明液稱取檸檬酸21g，N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸餾水溶解并稀釋至500ml?！静僮鳌?.準(zhǔn)備將緩沖液加入電泳槽的兩槽內(nèi)，并使兩側(cè)的液面等高。裁剪尺寸合適的濾紙條，疊成四層貼在電泳槽的兩側(cè)支架上，一端與支架前沿對齊，另一端侵入電泳槽的緩沖液內(nèi)，使濾紙全部濕潤，此即“濾紙橋”（圖3-1）。將醋酸纖維素薄膜切成2cm×8cm大小，在無光澤面的一端約1.5cm處，用鉛筆輕劃一直線，作為點樣位置。然后將無光澤面向下，置于盛有巴比妥緩沖液的培養(yǎng)皿中浸泡，待充分浸透（約20分鐘）即無白色斑點后取出，用潔凈濾紙輕輕吸去表面的多余緩沖液。2.點樣取少量血清于玻璃板上，用加樣器取少量血清(約2～3μl)，加在點樣線上，待血清滲入膜內(nèi)，移開加樣器。點樣時應(yīng)注意血清要適量，應(yīng)形成均勻的直線，并避免弄破薄膜（圖3-2）。3.平衡與電泳將點樣后的薄膜有光面朝上，點樣的一端靠近負(fù)極，平直地貼于電泳槽支架的濾紙上，平衡約5分鐘。蓋上電泳槽蓋，通電進行電泳。調(diào)節(jié)電壓為100～160伏，電流0.4～0.6mA／cm寬，夏季通電45分鐘，冬季通電60分鐘，待電泳區(qū)帶展開2.5～3.5cm時斷電。4.染色于β和γ-球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)“M”帶。【結(jié)果及