質譜流式細胞技術（CyTOF）常見FAQ

質譜流式細胞技術（CyTOF）常見FAQ問：CyTOF的檢測速度是多少？一管細胞需要檢測多久？答：CyTOF的檢測速度一般為500細胞/秒，如果檢測量為30萬個細胞的話，時間大約在10分鐘左右，每個樣本檢測量不同，根據檢測量檢測的時間會有上下浮動。問：CyTOF的樣本要求？我的樣本能做CyTOF嗎答：目前CyTOF檢測的樣本主要為人源樣本和小鼠源樣本，檢測類型包含外周血、骨髓、組織、細胞系、干細胞等多種樣本，CyTOF樣本的細胞量最好在4×106左右，且細胞活率應大于70%。問：CyTOF這項技術成熟嗎？和單細胞測序比怎么樣？答：CyTOF這項技術的相關文獻已發(fā)表2100多篇，其中30%發(fā)表在《nature》、《Science》、《Cell》及其子刊上，是在蛋白質層面研究單細胞的首選。單細胞測序作為一項同樣應用廣泛的單細胞研究技術，其檢測通量（1萬細胞）低于CyTOF（100萬細胞），同時單細胞測序檢測的是RNA層面，而CyTOF檢測的是蛋白層面。問：CyTOF在送樣時有什么要求嗎？答：除了要滿足細胞數(shù)量（4×106）和活率（70%）的要求外，寄送的樣本類型也有一定要求。即便是使用低溫和保存液保存，長時間的寄送也會導致組織和外周樣本有一定的損傷，因此為了樣本的最佳狀態(tài)，推薦遠距離寄送前自主制備成單細胞懸液，然后梯度凍存后再干冰寄送。問：CyTOF每個組做幾例比較合適？答：目前在文獻中報道的小鼠源樣本，一般每組至少5例以上才能保證具有統(tǒng)計意義。人源樣本的個體差異較大，需要根據實驗方案再設計，在疾病特征研究或者預后標志物的發(fā)現(xiàn)中，樣本量是在能力范圍內越多越好。問：CyTOF的抗體如何選擇？答：華盈生物目前設計了兩款CyTOF的抗體Panel，分別是針對人樣本的30markerPanel和小鼠樣本的33markerPanel，這兩個抗體組合可以覆蓋研究中常見的免疫細胞。同時也提供了10個左右的定制通道，可以根據研究目的進行選擇。同時可以進行抗體定制，在Panel中加入個性化的抗體。問：CyTOF的項目周期一般為多久？答：CyTOF項目周期主要根據樣本數(shù)量、抗體貨期、抗體是否需要定制來決定，如果僅使用固定Panel對20例以內的樣本進行分析，周期一般在6-8周左右。問：CyTOF定制的抗體有什么要求嗎？如何選擇合適的抗體？答：CyTOF抗體定制即在一抗末端偶聯(lián)金屬標簽，一抗在知名抗體廠商如：Abcam、CST、ThermoFisher、Biolegend等多個品牌中均有售賣。最適選擇是抗體的應用中包含：CyTOF，如果應用中沒有CyTOF可以選擇含有FlowCytometry的抗體?？贵w偶聯(lián)的周期較長，實驗風險也相對較大。問：CyTOF的數(shù)據結果是什么樣的？如何對這些數(shù)據結果進行分析呢？答：CyTOF數(shù)據結果為FCS格式文件，其中包含每一個細胞的所有marker的表達量，目前主流的平臺Cytobank和Flowjo均可以對CyTOF的結果進行處理和分析，同時一些高級分析在R上也可以實現(xiàn)，目前已有大量的CyTOF包在R上得到了廣泛的應用。華盈生物在項目中會提供CyTOF基礎分析，幫助您發(fā)現(xiàn)更多細胞中的差異。問：CyTOF實驗的單細胞懸液如何制備？有什么要求嗎？答：CyTOF檢測的樣本最終狀態(tài)為單細胞懸液，制備的方法與流式細胞術單細胞懸液制備方法基本一致，但是因為CyTOF最終檢測的是金屬離子，因此在制備過程中需要避免使用含有金屬離子的試劑和儀器，例如含有Ca2+、Mg2+的PBS溶液。問：CyTOF的預實驗需要做什么準備嗎？答：如果實驗涉及的抗體僅包含膜蛋白，在預實驗過程中僅需要測試一下抗體的最佳濃度，如果包含胞內蛋白則需要測試一下膜蛋白和胞內蛋白的染色順序。因此客戶在提供樣本時需要額外提供預實驗的樣本。問：CyTOF可以對胞內蛋白進行檢測嗎？答：CyTOF不僅可以對細胞的膜蛋白進行檢測還可以同步對胞內蛋白和核蛋白進行檢測，同步實現(xiàn)對細胞、細胞因子和細胞功能狀態(tài)的研究。問：CyTOF如何實現(xiàn)超多抗體的同步檢測的？答：CyTOF的抗體尾部連接了金屬及其同位素的標簽，每一個原子量就是一個通道，這種標簽系統(tǒng)代替了傳統(tǒng)的熒光標簽系統(tǒng)，不會出現(xiàn)譜帶重疊，同時開發(fā)的通道也非常多，可以實現(xiàn)30-50種蛋白的同步檢測，同時最終檢測系統(tǒng)為ICP-MS系統(tǒng)，可以對金屬標簽進行高精度的檢測，最終兩個系統(tǒng)結合實現(xiàn)超多抗體的同步檢測。問：CyTOF檢測后能給我們提供什么結果？答：在我們的樣本中免疫細胞的數(shù)量和種類都十分龐大，CyTOF可以對樣本中的幾十種免疫細胞的含量進行檢測，從而發(fā)現(xiàn)在治療或者疾病發(fā)生過程中出現(xiàn)變化的免疫細胞，同時還可以針對這些免疫細胞的細胞因子進行分析。相關性分析還能幫助我們找到有關聯(lián)的細胞亞型，發(fā)現(xiàn)組織中的細胞關系。問：CyTOF只能用于腫瘤研究嗎？其他的領域可以做這項技術嗎？答：目前CyTOF的應用領域非常廣泛，如血液、心血管、衰老、腫瘤、神經、自身免疫等多個研究方向，因此這項技術不僅僅可以對腫瘤進行研究，還可以在其他的研究方向發(fā)光發(fā)熱。同時這項技術不僅可以在基礎研究中幫助我們發(fā)現(xiàn)關鍵細胞機制，還可以結合臨床數(shù)據發(fā)現(xiàn)疾病預后標志細胞和疾病靶點。問：已經進行過單細胞測序檢測了，還有必要做CyTOF嗎？答：目前已經發(fā)表的文章中，有一部分研究人員會在單細胞測序后再使用CyTOF對之前的數(shù)據進行驗證，蛋白驗證核酸在我們的日?？蒲兄幸彩呛艹Ｒ姷?。同時因為單細胞測序檢測細胞量較少，難免會遺漏一些含量少的細胞，而這些含量少的細胞可能恰恰是疾病中的關鍵細胞，因此質譜流式可以幫助我們發(fā)現(xiàn)這樣稀少的細胞亞型。問：CyTOF發(fā)現(xiàn)差異細胞后如何進行下一步的研究呢？答：在我們使用CyTOF發(fā)現(xiàn)差異細胞之后我們可以針對這種細胞的功能進行研究，或者對細胞中的細胞因子進行研究；同時質譜流式可以研究細胞的狀態(tài)，可以從狀態(tài)方面入手發(fā)現(xiàn)細