大豆Gmubi和馬鈴薯Patatin2啟動(dòng)子在芥菜中的表達(dá)分析

大豆Gmubi和馬鈴薯Patatin2啟動(dòng)子在芥菜中的表達(dá)分析植物基因工程技術(shù)作為一種改良品種性狀的輔助手段,能夠加快選育的進(jìn)程。在植物基因工程的研究中,除了優(yōu)良基因的分離與克隆外,調(diào)控外源基因的表達(dá)的啟動(dòng)子也是重要研究的研究課題。啟動(dòng)子能夠在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游基因表達(dá),從而得到能夠抵御外界環(huán)境的脅迫、抗逆性增強(qiáng)和營養(yǎng)價(jià)值更高的植物新品種。植物基因工程中,往往需要目的基因在受體植物中大量高效表達(dá)。目前,在轉(zhuǎn)基因植物研究中,大多數(shù)使用組成型啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子和從木薯葉脈花葉病毒中分離的CsVMV啟動(dòng)子。然而,在利用基因工程對(duì)植物進(jìn)行改良的過程中,有時(shí)需要同時(shí)引入多個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)某特定性狀的控制,這無疑將使用到多個(gè)啟動(dòng)子。因此,人們需要去尋找更多有效的組成型啟動(dòng)子,實(shí)現(xiàn)植物復(fù)雜性狀的人工調(diào)控。另外,為實(shí)現(xiàn)外源基因在特定的部位或器官中表達(dá),需要大量用到組織特異性啟動(dòng)子或器官特異性啟動(dòng)子。該類啟動(dòng)子不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累,增加區(qū)域表達(dá)量,同時(shí)也可以避免過度的消耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)與能量而對(duì)植物自身的生長發(fā)育帶來不良的影響。針對(duì)上述情況,本論文將從植物大豆中克隆得到的Gmubi組成型啟動(dòng)子,從馬鈴薯中克隆得到Patatin2特異性啟動(dòng)子,與GUS基因融合分別構(gòu)建以Bar基因(對(duì)除草劑Basta具有抗性)為篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pCABarGmubiGus和pCABarPatatin2Gus,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入渝豐芥菜,研究兩個(gè)啟動(dòng)子在異源生物中的表達(dá)特性,為今后利用上述啟動(dòng)子在植物中進(jìn)行基因功能分析以及轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。具體獲得的結(jié)果如下：1.Gmubi啟動(dòng)子的克隆及功能分析載體構(gòu)建根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的大豆polyubiquitin(ubi)基因啟動(dòng)子序列(EU310508.1),設(shè)計(jì)引物從大豆DNA中擴(kuò)增到大小約0.9kb片段,克隆到pBluescript載體上進(jìn)行測序驗(yàn)證。序列分析顯示擴(kuò)增到的序列長度為917bp,與EU310508.1目標(biāo)序列有7個(gè)核苷酸不一致,序列一致性為99%。用HindⅢ+Ncol酶切下917bp的Gmubi替換載體PCABarGus中的35S啟動(dòng)子,獲得表達(dá)載體PCABarGmubiGus。2.Patatin2啟動(dòng)子的克隆及功能分析載體構(gòu)建根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的馬鈴薯PatatinClassII啟動(dòng)子序列(X60398.1),設(shè)計(jì)引物從馬鈴薯DNA中擴(kuò)增到大小約0.7kb片段,克隆到pBluescript載體上進(jìn)行測序驗(yàn)證。序列分析顯示擴(kuò)增到的序列長度為669bp,與X60398.1目標(biāo)序列有4個(gè)核苷酸不一致,序列一致性為99%。用HindIII+NcoI酶切下677bp的Patatin2替換載體PCABarGus中的35S啟動(dòng)子,獲得表達(dá)載體PCABarPatatin2Gus。3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因芥菜植株利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將構(gòu)建的兩個(gè)植物表達(dá)載體pCABarGmubiGus、pCABarPatatin2Gus和陽性對(duì)照pCABar35SGus用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化“渝豐”榨菜下胚軸,通過PPT(phosphinothricin,膦絲菌素)的多輪篩選獲得轉(zhuǎn)基因芥菜植株。4.轉(zhuǎn)基因芥菜植株的分子檢測提取轉(zhuǎn)基因植株DNA用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用Gmubi啟動(dòng)子引物從10株pCABarGmubiGus除草劑抗性植株中檢測到6株抗性植株含有Gmubi啟動(dòng)子序列。用HPatatin2啟動(dòng)子引物從10株pCABarPatatin2Gus除草劑抗性植株中檢測到5株抗性植株含有Patatin2啟動(dòng)子序列。5.pCABarGmubiGus、pCABarPatatin2Gus轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)分析pCABar35SGus對(duì)照轉(zhuǎn)基因芥菜植株葉、莖、花、種子、根均具有很強(qiáng)的GUS活性,而非轉(zhuǎn)基因野生型芥菜葉、莖、花、種子、根均無GUS活性。pCABarGmubiGus轉(zhuǎn)基因芥菜植株的葉、莖、花、種子、根均具有很強(qiáng)的GUS活性,表明Gmubi啟動(dòng)子能夠在芥菜中組成型表達(dá)。然而,對(duì)獲得的所有pCABarPat