表皮葡萄球菌聚集相關(guān)蛋白(Aap)作為抗細(xì)菌生物膜疫苗候選抗原的研究

表皮葡萄球菌聚集相關(guān)蛋白（Aap）作為抗細(xì)菌生物膜疫苗候選抗原的研究凝固酶陰性的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)為人體皮膚表面常見的共生菌,通常不致病。但近年來隨著各種植入性醫(yī)療材料的廣泛使用,表皮葡萄球菌已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌,主要原因是其能在這些醫(yī)療材料表面形成生物膜(biofilm)結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)能夠很好地保護(hù)細(xì)菌抵抗多種抗生素的治療和人體免疫系統(tǒng)的攻擊,并從中不斷釋放細(xì)菌,從而造成機體的反復(fù)感染,最終將導(dǎo)致醫(yī)療材料植入的失敗,對患者造成極大的痛苦和對社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外,由于抗生素的大量使用導(dǎo)致表皮葡萄球菌多重耐藥株的發(fā)生率日趨增高,因此急需開發(fā)預(yù)防和治療葡萄球菌感染的新方法,尤其是開發(fā)能夠有效抗表皮葡萄球菌生物膜的疫苗。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌粘附在有機或無機材質(zhì)表面形成的由細(xì)菌及大量細(xì)胞外粘附分子組成的多層細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分為三個階段,初始粘附、增殖聚集及生物膜成熟。在生物膜形成的初始粘附階段,細(xì)菌通過大量粘附分子(Adhesin)直接或間接粘附于醫(yī)療材料的表面。當(dāng)完成初始粘附后,細(xì)菌在大量分裂增殖的同時,開始以細(xì)菌表面或分泌至細(xì)胞外的多種粘附分子為介導(dǎo),相互粘附并聚集形成一種多層的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。最終,當(dāng)大量細(xì)菌聚集并在醫(yī)療材料表面形成生物膜后,生物膜表面的細(xì)菌開始從生物膜上脫落,并隨生物膜外的體液播散至其他部位進(jìn)而形成新的生物膜。由于在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程中,眾多的粘附分子對細(xì)菌的粘附和聚集起到了十分重要的作用,因此研究上述細(xì)菌粘附分子在生物膜形成中的作用,并研究粘附分子的特異性抗體對細(xì)菌粘附聚集能力和生物膜形成能力的影響,便能為抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程當(dāng)中,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的能夠介導(dǎo)細(xì)菌間相互粘附聚集的粘附分子主要有三大類,多糖細(xì)胞間粘附因子(PIA)、蛋白粘附因子、以及細(xì)胞外DNA(eDNA)。在這三類粘附分子中,Aap蛋白是一種表達(dá)于表皮葡萄球菌細(xì)胞壁表面的重要的蛋白粘附分子。Aap蛋白介導(dǎo)的細(xì)菌間相互粘附聚集主要是通過其A結(jié)構(gòu)域被蛋白酶水解后,其B結(jié)構(gòu)域在Zn2+存在條件下發(fā)生同源二聚化而實現(xiàn)的。已有文獻(xiàn)報道,針對Aap蛋白的抗體可以有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成,因此提示Aap蛋白很可能成為抗表皮葡萄球菌生物膜的候選疫苗。本課題目的是以表皮葡萄球菌Aap蛋白為研究對象,研究其介導(dǎo)表皮葡萄球菌粘附聚集及生物膜形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,并通過詳細(xì)研究其單克隆抗體對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響綜合分析評價Aap蛋白作為抗生物膜疫苗候選抗原的可能性,同時確定Aap蛋白誘導(dǎo)抗生物膜抗體產(chǎn)生的抗原表位,從而為丌發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的疫苗奠定理論和實踐基礎(chǔ)。第一章表皮葡萄球菌Aap蛋白介導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域基本功能單位的確定在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程中,Aap蛋白介導(dǎo)的細(xì)菌間相互粘附聚集發(fā)揮了極為關(guān)鍵的作用,針對Aap蛋白的抗體可以明顯抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成,因此Aap蛋白可以作為抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的候選抗原。然而因Aap蛋白分子量較大(140-300kDa),所以利用大腸桿菌原核重組表達(dá)全長的Aap蛋白難以實現(xiàn)較高的蛋白產(chǎn)量,導(dǎo)致很難利用全長Aap蛋白制備疫苗；同時由于Aap蛋白是表皮葡萄球菌中的一種優(yōu)勢抗原,直接運用這種來源于細(xì)菌的大分子蛋白制備的疫苗安全性較低,難以用于人體的全身免疫?；谏鲜鲈?利用Aap蛋白作為抗原研發(fā)相關(guān)的疫苗產(chǎn)品,只能在Aap蛋白中尋找其介導(dǎo)細(xì)菌間相互粘附聚集和生物膜形成的關(guān)鍵區(qū)域,并且以該區(qū)域為抗原進(jìn)一步研究其是否能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗生物膜的抗體,從而為后續(xù)的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。通過對Aap蛋白的生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)Aap蛋白由N端信號肽、A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、P/G富集結(jié)構(gòu)域和C端的LPXTG細(xì)胞壁錨鏈基序組成。在不同的表皮葡萄球菌菌株中,由高度保守的重復(fù)元件反復(fù)重復(fù)串聯(lián)構(gòu)成的B結(jié)構(gòu)域是Aap蛋白中變異最大的區(qū)域,不同菌株Aap蛋白該區(qū)域含有的重復(fù)元件數(shù)量不同,RP62A、ATCC12228和5179株Aap蛋白的B結(jié)構(gòu)域分別含有12個、6個和5個重復(fù)元件。利用穿梭質(zhì)粒pCN51在肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)中過表達(dá)表皮葡萄球菌ATCC12228株Aap蛋白的B結(jié)構(gòu)域,原本不能形成生物膜的肉葡萄球菌形成了較為明顯的細(xì)菌生物膜。說明ATCC12228株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)細(xì)菌生物膜的形成,即使其含有重復(fù)元件的數(shù)量不同于生物膜形成陽性菌株RP62A或5179株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域中含有重復(fù)元件的數(shù)量。該結(jié)果提示,Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域正確空間構(gòu)象的形成及其介導(dǎo)細(xì)菌粘附聚集的功能同其含有的重復(fù)元件的數(shù)量沒有相關(guān)性,各重復(fù)元件可能獨立行使功能。進(jìn)一步克隆、表達(dá)、純化“Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域最后一個重復(fù)元件及其后的不完整重復(fù)元件”,即AapBrpt1.5后,利用Native和生物膜微孔板半定量實驗分別研究AapBrpt1.5的聚合狀態(tài)及其對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響。AapBrpt1.5在Zn2＋的介導(dǎo)下可以發(fā)生多聚化,同時AapBrpt1.5還可以競爭性抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成(抑制作用和濃度成正比)。因此我們認(rèn)為,B結(jié)構(gòu)域中的每個重復(fù)元件都是一個可以在Zn2＋介導(dǎo)下發(fā)生多聚化的獨立區(qū)域,AapBrpt1.5是Aap蛋白介導(dǎo)細(xì)菌間相互粘附聚集和生物膜形成的基本功能單位。此外,通過AapBrpt1.5免疫小鼠得到免疫血清后,利用激光共聚焦顯微鏡觀察了小鼠免疫血清對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響?？笰apBrpt1.5小鼠血清可以明顯抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成。AapBrpt1.5作為Aap蛋白介導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成的基本功能單位,可以代替全長的Aap蛋白作為一個合適的抗原而用于后續(xù)的抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研發(fā)。第二章表皮葡萄球菌Aap蛋白誘導(dǎo)抗生物膜抗體產(chǎn)生的抗原表位確定既往研究證明,Aap蛋白在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中具有非常重要的作用,并且其抗體可以抑制細(xì)菌生物膜的形成,提示Aap蛋白可以作為抗生物膜的候選疫苗。但是由于全長Aap蛋白的抗原性過強、分子量過大,限制了其作為疫苗的應(yīng)用前景。隨著單克隆抗體技術(shù)和抗原表位測定技術(shù)的發(fā)展,為在Aap蛋白中尋找能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗生物膜抗體的抗原表位提供了有力的條件。這種抗原表位的多肽很有可能成為最佳的抗生物膜的候選疫苗?；诖四康?我們研究了小鼠抗Aap單克隆抗體對表皮葡萄球菌聚集能力和生物膜形成的影響,并測定了各單克隆抗體的抗原表位,為基于該表位的抗生物膜表位多肽疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。首先,利用Aap蛋白介導(dǎo)生物膜形成的基本功能單位AapBrpt1.5作為抗原,我們制備了小鼠抗Aap單克隆抗體：MAb18B6、MAb25C11和MAb20B9。利用ELISA和WesternBlot分別檢測各抗體的效價及抗原識別力等免疫反應(yīng)性,3株單克隆抗體(IgG)對AapBrpt1.5具有很高的抗原親和力(效價≥1：1280000/0.4mg/mL),同時3株單克隆抗體都可以與表皮葡萄球菌(RP62A和ATCC12228株)Aap蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。利用蛋白截短聯(lián)合免疫共沉淀法對3株單克隆抗體抗原表位的測定表明,MAb18B6位于AapBrpt1.5中抗原識別位點的序列與表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域各重復(fù)元件中相應(yīng)位點的序列完全一致；而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位序列僅與RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域中部分重復(fù)元件相應(yīng)位點的序列完全一致,而在其他重復(fù)元件中的相應(yīng)位置存在有氨基酸殘基的變異。繼而,利用生物膜微孔板半定量實驗和激光共聚焦顯微鏡研究小鼠抗Aap單克隆抗體對表皮葡萄球菌生物膜形成和細(xì)菌聚集狀態(tài)的影響,MAb18B6可以抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成(抑制率≤40%),但是MAb25C11和MAb20B9卻可以促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成(促進(jìn)率≤30%)。此外,3株單克隆抗體都可以促使浮游生長的表皮葡萄球菌發(fā)生較為明顯的聚集并形成細(xì)菌團(tuán)塊。結(jié)合對3株單克隆抗體抗原表位測定的結(jié)果,我們認(rèn)為不同單克隆抗體對細(xì)菌生物膜形成的影響同其識別的抗原表位有關(guān)。MAb18B6抗原表位位于表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域重復(fù)元件中的保守區(qū)域,MAb18B6可以結(jié)合并抑制B結(jié)構(gòu)域中各個重復(fù)元件的二聚化作用,并抑制分屬于兩個細(xì)菌表面的Aap蛋白分子間的拉鏈狀聚合,從而抑制細(xì)菌生物膜的形成；而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位位于RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域重復(fù)元件中的非保守區(qū)域,它們只能結(jié)合并抑制B結(jié)構(gòu)域中部分重復(fù)元件的二聚化作用,因此它們對Aap蛋白分子間拉鏈狀聚合的抑制作用明顯低于MAb18B6,從而缺乏對細(xì)菌生物膜形成的抑制作用。隨后,分別利用Dot-blot、WesternBlot及免疫熒光、熒光定量PCR分別測定表皮葡萄球菌中細(xì)胞外粘附因子Aap、eDNA及PIA的生物合成,3株單克隆抗體都可以促進(jìn)浮游細(xì)菌和生物膜表面細(xì)菌Aap蛋白的表達(dá),并可以促進(jìn)生物膜中PIA的合成及eDNA的釋放。這些改變都可以促進(jìn)細(xì)菌間的相互粘附聚集,進(jìn)而促使浮游的細(xì)菌聚集成團(tuán),并增強細(xì)菌生物膜的形成。因此,小鼠抗Aap單克隆抗體對表皮葡萄球菌細(xì)菌間粘附聚集和生物膜形成的影響存在兩種相互矛盾的作用：其一,通過結(jié)合Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域重復(fù)元件中相應(yīng)區(qū)域而抑制Aap蛋白二聚化并抑制細(xì)菌生物膜的形成；其二,通過影響細(xì)菌細(xì)胞外粘附因子的生物合成而促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成。MAb25c11和MAb20B9本身缺乏對Aap蛋白二聚化的抑制能力,同時又上調(diào)了細(xì)菌細(xì)胞外粘附因子的生物合成,所以其對生物膜形成的作用最終表現(xiàn)為促進(jìn)；MAb18B6雖然同樣可以上調(diào)細(xì)菌細(xì)胞外粘附因子的生物合成,但是由于其具有較強的阻斷Aap蛋白二聚化的能力,所以上調(diào)了的細(xì)胞外粘附因子的生物合成只是削弱了其對生物膜形成的抑制作用,MAb18B6最終顯示出對生物膜形成的抑制。所以只有選擇合適的Aap表位多肽作為疫苗,誘導(dǎo)產(chǎn)生具有較強抑制生物膜作用的抗體,才能達(dá)到預(yù)防生物膜形成的目的；反之,不適當(dāng)?shù)谋砦灰呙缯T導(dǎo)產(chǎn)生的抗體反而可能會增強細(xì)菌生物膜的形