分子生物學(xué)課件

癌基因與抑癌基因癌基因和抑癌基因癌基因和抑癌基因在細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用癌基因和抑癌基因與腫瘤發(fā)生捕獲致癌兇手

—病毒致癌理論，勞斯(Rous)

獲1966年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)Rous：1907年，從母雞身上的惡性結(jié)締組織（肉瘤）中提取濾液，接種到健康的雞體內(nèi)，雞患上同樣的腫瘤。表明：濾液中含致病原，可傳播腫瘤。1932年，Shope發(fā)現(xiàn)，野生棉尾兔的皮膚腫瘤也可借助無(wú)細(xì)胞濾液傳播。腫瘤進(jìn)展：開(kāi)始，癌細(xì)胞處于“休眠”狀態(tài)，被化學(xué)因子、病毒等喚醒后，變的無(wú)法無(wú)天。病毒致癌理論：即傳播腫瘤的無(wú)細(xì)胞濾液中含的是病毒。勞斯(Rous)，獲1966年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)改寫(xiě)中心法則

—逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)

特明(Temin)和巴爾的摩(Baltimore)

獲1975年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)轉(zhuǎn)化：通過(guò)病毒的誘導(dǎo)，正常細(xì)胞可轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)化細(xì)胞中不產(chǎn)生病毒粒子。結(jié)論：病毒的遺傳物質(zhì)被結(jié)合到轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中，細(xì)胞獲得來(lái)自病毒的遺傳特性。Temin：勞氏肉瘤病毒（RSV），RNA病毒。推測(cè)：RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA后，整合到細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中。Baltimore：發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。癌基因探密

—畢曉普(Bishop)和瓦慕斯(Varmus)獲1989年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)Bishope,Varmous：勞氏肉瘤病毒如何使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性生長(zhǎng)的？研究表明：勞氏肉瘤病毒的致癌能力與病毒基因組的單個(gè)基因有關(guān)，即src基因。

src基因本是正常細(xì)胞基因組的一部分（原癌基因），被病毒“劫持”后，病毒則具有致癌能力。原癌基因在正常細(xì)胞中的地位：調(diào)控細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞中癌基因的變化：過(guò)分活躍或突變，使其編碼產(chǎn)物改變。癌基因和抑癌基因癌基因(oncogene,onc)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性病毒癌基因(virusoncogene,v-onc)病毒所攜帶的致轉(zhuǎn)化因子命名：逆轉(zhuǎn)錄病毒株結(jié)合其所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，3個(gè)字母，如abl等細(xì)胞癌基因(celloncogene,c-onc)即原癌基因(protooncogene)：未激活的癌基因，促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、發(fā)育等

v-onc與c-onc的不同V-onc無(wú)內(nèi)含子外顯子有微小差別V-onc常出現(xiàn)堿基取代或缺失等突變癌基因家族據(jù)基因結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)分為：

src家族：abl、fes、fgr、fps、fym、kck等，編碼產(chǎn)物多具有蛋白酪氨酸激酶活性

ras家族：H-ras、K-ras、N-ras，表達(dá)產(chǎn)物為信息傳遞分子，編碼的蛋白質(zhì)為P21myc家族：c-myc、fos等，表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)，屬DNA結(jié)合蛋白sis家族e(cuò)rb家族：表達(dá)產(chǎn)物為細(xì)胞骨架蛋白myb家族：表達(dá)產(chǎn)物為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子抑癌基因(tumorsuppressorgene)正常細(xì)胞內(nèi)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，潛在抑癌作用的基因此類(lèi)基因突變、缺失或失活，引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、負(fù)調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物：跨膜受體、胞質(zhì)調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期因子等癌基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用生長(zhǎng)因子及其類(lèi)似物受體類(lèi)：蛋白酪氨酸激酶低分子量G蛋白胞內(nèi)蛋白激酶胞漿調(diào)節(jié)蛋白核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子癌基因和抑癌基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用細(xì)胞周期及其調(diào)控細(xì)胞間期(G1期、S期、G2期)和有絲分裂期兩個(gè)調(diào)控點(diǎn)：G1/S轉(zhuǎn)折點(diǎn)、G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn)從增殖角度，細(xì)胞可分為三類(lèi)連續(xù)分裂的細(xì)胞：周期性細(xì)胞，如小腸絨毛上皮隱窩細(xì)胞休眠細(xì)胞（G0期細(xì)胞）：暫時(shí)脫離細(xì)胞周期，如肝、腎細(xì)胞終端分化細(xì)胞：如神經(jīng)、肌肉細(xì)胞原癌基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用有些原癌基因是細(xì)胞周期蛋白的成員抑癌基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用抑制細(xì)胞周期于靜止期，并使復(fù)制不完全或受損傷的DNA不能進(jìn)入分裂期。Rb基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用P53基因在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用WT1基因癌基因惡性激活的機(jī)制原癌基因點(diǎn)突變?cè)┗蚧颢@得外源啟動(dòng)子而激活原癌基因甲基化程度降低而激活原癌基因的拷貝數(shù)增加而激活基因易位或重排使原癌基因激活癌基因激活與腫瘤的發(fā)生腫瘤發(fā)生學(xué)說(shuō)啟動(dòng)階段、促癌階段、演進(jìn)階段癌基因激活與腫瘤發(fā)生Ras基因變異與腫瘤發(fā)生Myc基因變異與腫瘤發(fā)生抑癌基因失活與腫瘤發(fā)生Rb基因P53基因P16基因腫瘤發(fā)生的多基因協(xié)同學(xué)說(shuō)亨廷頓舞蹈癥表現(xiàn)：生理上失控，如肌肉萎縮；身體衰弱，癡呆中年發(fā)病，遺傳缺陷被保留，代代相傳1968年，魏斯樂(lè)、艾麗絲、南西、李諾委內(nèi)瑞拉，收集家族圖譜，采血樣，空運(yùn)1982年，谷塞拉，DNA探針（RFLP）與DNA比對(duì)第三個(gè)G8探針，配合病人DNA一起出現(xiàn)，不配合健康者，康尼利，電腦分析，連鎖比率很高，“幸運(yùn)吉姆”，1983年，Nature，在4號(hào)染色體上杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）肌肉萎縮癥，始于童年早期，漸漸消耗病人肌肉，X染色體缺陷，找不到病因?！胺崔D(zhuǎn)遺傳學(xué)”：從疾病源頭找起1970年，布萊爾，三種疾病：慢性肉芽腫（免疫）；視力惡化（色素性視網(wǎng)膜炎）；DMD猜測(cè)：X染色體有較大的缺失1979年，女孩，DMD。X染色體短臂（XP21）一段DNA缺失，該位置是否是DMD基因所在位置1981年，康克爾，BBcell，將正常X染色體DNA切割后，與BB細(xì)胞XDNA切割后雜交，有8段不能雜交上，說(shuō)明在BB細(xì)胞中缺失；用這8段作探針，與其他DMD患者雜交，第8號(hào)無(wú)法與其他5人雜交，說(shuō)明該探針與DMD有關(guān)。1985年，探針太短，DMD基因出奇長(zhǎng)新問(wèn)題：鑒定出一段DNA后，如何知道它是DMD的一部分，因不知DMD產(chǎn)物DNA動(dòng)物園，探針檢查，鼠、猴等也可黏附，可能是基因的一部分，1986年，Nature1987年，8段DMA基因，平均150bp，散在13萬(wàn)bp的DNA片段上，占人類(lèi)基因組的1/1000找關(guān)鍵蛋白質(zhì)，“抗體”。鼠DMD基因片段→植入細(xì)菌→產(chǎn)生蛋白質(zhì)→接種兔子→抗體→對(duì)正常人肌肉組織起反應(yīng)，對(duì)DMD肌肉不起反應(yīng)抗肌萎縮蛋白作用：極薄的組織鞘，包在肌纖維外薄膜上，提高機(jī)械強(qiáng)度治療：提供抗肌萎縮蛋白或另一替代蛋白，建立鼠模型雙重打擊理論1985年，5周大男孩，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，放射線治療，預(yù)測(cè)癌癥卡威尼，RB，13號(hào)染色體缺失一段，太復(fù)雜克努森，1971年，多重打擊女孩，RB，智力障礙，13號(hào)損傷標(biāo)記：酯酶D，緊密連鎖，RB基因代理人尋找第二個(gè)打擊：失去單個(gè)酯酶D基因，酯酶D量減半；失去兩個(gè)酯酶D基因，無(wú)酯酶D3歲女孩，患RB，全身酯酶D只有正常人一半，而眼癌中組織，無(wú)酯酶D尋找該基因，RFLP從病孩13號(hào)染色體切下的兩截片段，竟一樣長(zhǎng)，都與父親一樣，似乎從父親傳到兩段受損的染色體，而未傳到母親的。解釋：父親缺損的染色體又復(fù)制一次，替代了母親的。原因：互換，父母染色體同一段交叉，子代有成對(duì)父親染色體，若是RB異?；?，子代將有兩條缺少該基因的13號(hào)染色體，即“第二次打擊”。1983年，Nature，卡威尼證實(shí)了克努森的“雙重打擊學(xué)說(shuō)”。RB基因被稱為抑癌基因，有一個(gè)，不患癌癥；都缺失，患癌癥?？ㄍ幔瓿墒桌┌Y預(yù)測(cè)克努森，癌癥生成的新理論之父，“原創(chuàng)、清晰的想象”。結(jié)腸癌美國(guó)第二號(hào)癌癥死因，家族遺傳異常。進(jìn)程：直腸息肉→惡性→布滿腸壁→惡性細(xì)胞進(jìn)入血液→流傳到其他器官1981，史古尼克，查家族息肉，摩門(mén)教徒的猶他家族，191人，21%患腺瘤息肉，配偶組，9%患病，顯性遺傳弗吉斯坦，維耳姆氏瘤（兒童腎臟癌），11號(hào)染色體缺失。查結(jié)腸癌，癌癥進(jìn)程清楚，是否不同病程，失落不同基因？查11號(hào)、13號(hào)，沒(méi)收獲。查文獻(xiàn)，看是否有人看到DNA缺失遺傳學(xué)雜志，一結(jié)腸癌病例，腫瘤細(xì)胞中17號(hào)染色體兩只長(zhǎng)臂融合，短臂失落；18號(hào)缺損。查17號(hào)，腫瘤細(xì)胞17號(hào)缺損，健康組織中存在，息肉中無(wú)DNA缺失懷特，水牛城男童，患FAP（遺傳性腺瘤息肉）和智障，5號(hào)染色體；包得摩，5號(hào)染色體探針，正常人有，F(xiàn)AP沒(méi)有；遺傳到一個(gè)，長(zhǎng)息肉；兩個(gè)缺失，息肉轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y疾病相關(guān)染色體：17、18、5、11（ras）1989，尋找基因：17號(hào)，p53基因，健康組織，雙套p53基因；腫瘤單個(gè)p53基因且點(diǎn)突變?！半p重打擊”，p53基因?yàn)橐职┗?。P53基因重要性不僅限于結(jié)腸癌，其他如乳腺癌、腦癌、肺癌等，“分子警察”。1990，18號(hào)，DCC基因，制造的蛋白質(zhì)具膠合功能，基因改變，細(xì)胞膠消失，細(xì)胞生長(zhǎng)限入混亂。一、試述真核生物轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控。二、舉例說(shuō)明G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。三、說(shuō)明“插入滅活法”如何篩選帶重組體克隆。四、反義RNA如何用于基因治療？五、請(qǐng)你為《分子生物學(xué)》課程提意見(jiàn)或建議一、試述真核生物DNA水平的調(diào)控。二、舉例說(shuō)明單次跨膜受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。三、說(shuō)明“α-互補(bǔ)法”如何篩選帶重組體克隆。四、核酶如何用于基因治療？五、請(qǐng)你為《分子生物學(xué)》課程提意見(jiàn)或建議

第三節(jié)癌基因癌基因已被證實(shí)是正常存在于生物(包括人類(lèi))基因組內(nèi)的,它的結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常,也的確可以引起細(xì)胞癌變.一癌基因本世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)某些病毒對(duì)動(dòng)物有致癌作用70年代從逆轉(zhuǎn)錄病毒中發(fā)現(xiàn)癌基因(oncogene,onc)80年代初在人膀胱癌細(xì)胞株中證實(shí)有oncogene(一)病毒癌基因1911PeytonRous發(fā)現(xiàn)雞肉瘤病毒(RSV)可以致癌,其中與致癌有關(guān)的基因src稱為癌基因1966諾貝爾獎(jiǎng)Bishop,Varmas證實(shí)RSV中的src不是逆轉(zhuǎn)錄病毒固有的,而是來(lái)自宿主基因組的src基因1989諾貝爾獎(jiǎng)致瘤病毒中存在的某些核苷酸序列稱為癌基因,即病毒癌基因(v-onc)人類(lèi)常見(jiàn)的致瘤病毒RNA病毒人類(lèi)T淋巴性病毒Ⅰ(HTLV-Ⅰ)DNA病毒EBV,HSV,HCMV,Ad習(xí)慣上,將逆轉(zhuǎn)錄病毒上所含的致癌基因稱為v-onc,而將宿主細(xì)胞基因組中的同源基因稱為原癌基因或細(xì)胞癌基因(二)細(xì)胞癌基因(cellularoncogene,c-onc)細(xì)胞癌基因是指真核細(xì)胞中存在的一段核苷酸序列,這段核苷酸序列在正常細(xì)胞中以非激活形式存在,故又稱原癌基因(proto-onc).在某些特定條件下激活可致癌變?cè)┗蚓哂袃?nèi)含子和外顯子(三)原癌基因分類(lèi)原癌基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物分布于細(xì)胞膜,細(xì)胞質(zhì),或細(xì)胞核根據(jù)蛋白產(chǎn)物的功能分為幾大類(lèi):1.生長(zhǎng)因子(growthfactor,GF)及其類(lèi)似物,以及生長(zhǎng)因子受體(GF--R)2.酪氨酸蛋白激酶:某些酶蛋白磷酸化(ser)3.GTP結(jié)合蛋白:影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)系統(tǒng)4.核內(nèi)蛋白質(zhì):結(jié)合DNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,甚至影響復(fù)制由此可將癌基因分為相應(yīng)的幾類(lèi),或稱癌基因家族用三個(gè)字母來(lái)表示,超過(guò)100個(gè)src家族ras家族myc家族sis家族e(cuò)rb家族(四)癌基因的激活原癌基因正常情況下行使正常的調(diào)控功能,,在某些特定因素作用下,其結(jié)構(gòu)或調(diào)控發(fā)生異常,使之激活才具有致癌活性致癌機(jī)理1.調(diào)節(jié)序列的插入啟動(dòng)子,增強(qiáng)子2.基因突變膀胱癌細(xì)胞株EJ和T24中,點(diǎn)突變激活C-rasH癌基因,造成細(xì)胞癌基因大量表達(dá)3.基因重排染色體異位burkitt淋巴瘤

t(8;14)8q24→14q32C-myc被激活4.基因擴(kuò)增原癌基因復(fù)制多個(gè)拷貝5.基因偶聯(lián)某些原癌基因在特定條件下因其它原癌基因首先激活而序貫活化稱為基因偶聯(lián)癌變的發(fā)生是多階段，不同階段相繼或同時(shí)又不同癌基因激活二抑癌基因(tumorsuppressergene)遺傳性腫瘤細(xì)胞中特定染色體或染色體的某一部分丟失丟失的這一部分可能對(duì)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有抑制作用因此推測(cè)在此染色體上存在抑癌基因1986年視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)隱性癌基因Rb被克隆并測(cè)序,抑癌基因首次被證實(shí)已發(fā)現(xiàn)的抑癌基因有10余種,都是通過(guò)缺失或失活而致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的1.P53基因1979年發(fā)現(xiàn),53kD的磷酸化蛋白,細(xì)胞核內(nèi),17p13.1野生型p53基因稱為抑癌基因,正常p53的生物功能好似“分子警察”:G1期檢查DNA損傷點(diǎn),監(jiān)視細(xì)胞基因組的完整性.如有損傷,P53蛋白阻止DNA復(fù)制,以提供足夠的時(shí)間讓損傷DNA修復(fù).如果修復(fù)失敗,P53蛋白則引發(fā)細(xì)胞程序性死亡,阻止具有基因損傷,可能誘發(fā)癌變的細(xì)胞產(chǎn)生.2.Rb基因13p14105kDP105-Rb細(xì)胞核內(nèi)一類(lèi)DNA結(jié)合蛋白R(shí)b蛋白的磷酸化/去磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的主要形式3.其他抑癌基因:DCC基因,NF1基因,MCC基因抑癌基因作用機(jī)制涉及基因表達(dá)調(diào)控,細(xì)胞分裂,分化過(guò)程,也可能與GF,激酶,信息在胞內(nèi)的傳遞密切相關(guān)三、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系

分子醫(yī)學(xué)molecularmedicine（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)（二）發(fā)展生物制藥基因工程藥物基因工程疫苗（三）DNA診斷基因診斷

基因診斷—用分子生物學(xué)的技術(shù)對(duì)引起疾病的原因--遺傳基因,致病微生物和寄生蟲(chóng),以及某些惡性腫瘤在基因水平上進(jìn)行病原學(xué)和細(xì)胞遺傳基因的檢測(cè)和分析.DNA/RNA（四）基因治療genetherapy基因治療—就是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能基因，以糾正或補(bǔ)償其基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的?；蛑脫Q基因修正基因修飾產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷細(xì)胞基因失活反義技術(shù)封閉基因,抑制有害基因?qū)ο篌w細(xì)胞生殖細(xì)胞1990.9.14首例基因治療4歲女孩嚴(yán)重免疫缺陷癥(SCID)缺乏腺苷酸脫氨酶(ADA)2--脫氧腺苷含量升高毒性嚴(yán)重破壞免疫功能ADA基因LN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶細(xì)胞為病人淋巴細(xì)胞回輸（五）遺傳病的預(yù)防產(chǎn)前診斷攜帶者測(cè)試癥候前診斷遺傳病易感性第二節(jié)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)與功能

一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中也有一些特定的序列能阻礙蛋白質(zhì)表現(xiàn)出生物功能，只有將其切除后才能形成有活性的蛋白質(zhì)。如牛胰島素原和酶原。分子病：基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)出生理功能的異常，使機(jī)體出現(xiàn)病態(tài)現(xiàn)象。如鐮刀狀紅細(xì)胞貧血。二級(jí)結(jié)構(gòu)與功能α-螺旋（α-helix）、β-折疊（β-pleatedsheet）、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲（randomcoil）、π-螺旋及Ω環(huán)（Ω-loop）。α-螺旋多的蛋白質(zhì)分子緊密、穩(wěn)定。如毛發(fā)、細(xì)菌纖毛的蛋白質(zhì)。富含β-折疊的蛋白如絲心蛋白柔軟有強(qiáng)度,但缺乏彈性.蛋白質(zhì)超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)(supersecondarystructure):相互鄰近的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集，形成更高一級(jí)的有規(guī)律的結(jié)構(gòu)。1973年，Rossman提出。三種基本形式：(αα)、（βαβ）、（βββ）.超二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成主要是氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)間相互作用的結(jié)果。結(jié)構(gòu)域（domain）：某些較大的球狀蛋白質(zhì)分子多肽鏈往往形成幾個(gè)緊密的構(gòu)象，彼此分開(kāi)，各行其功能。1970年Edelman描述IgG分子構(gòu)象提出。功能域是蛋白質(zhì)分子中能獨(dú)立存在的功能單位，可以由一個(gè)或幾個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。一些具有不同功能的蛋白質(zhì)可能具有某個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域。如枯草桿菌蛋白酶、己糖激酶和磷酸化酶中都含有一個(gè)核苷酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)分子的一條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)和超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤(pán)旋和折疊形成的空間結(jié)構(gòu)，靠次級(jí)鍵維系，二硫鍵加固。親水基團(tuán)朝外翻，疏水基團(tuán)朝內(nèi)鉆。三級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性是其功能的基礎(chǔ)。若蛋白質(zhì)嚴(yán)密有序的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，則其生理功能喪失。四級(jí)結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)分子中亞基的空間排布和相互間的布局。具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的功能活性可以通過(guò)變構(gòu)作用（allostericeffect）而被調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)變構(gòu)有兩種模式：

第三節(jié)生物大分子的相互作用生物大分子相互作用的力

非共價(jià)鍵的作用。離子鍵、氫鍵、vanderwaals力、疏水鍵。信息的傳遞及利用極大地依賴弱的非共價(jià)鍵。它們不僅決定著生物大分子的三維結(jié)構(gòu)，還決定著這些結(jié)構(gòu)如何與其它結(jié)構(gòu)相互作用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用

（protein-proteininteraction）蛋白質(zhì)通過(guò)分子之間的相互作用實(shí)現(xiàn)其特異的生物學(xué)功能。如蛋白質(zhì)酶的催化作用需要酶與特異作用物之間的相互識(shí)別、結(jié)合成中間復(fù)合物；抗體參與的防御功能需要抗體與抗原之間的特異識(shí)別與結(jié)合。1、蛋白質(zhì)的基元（motif）與結(jié)構(gòu)域由α螺旋和β片層參與的特定組合稱為基元或模體。常見(jiàn)模體有：β發(fā)夾：由位于同一層面內(nèi)的兩條反向平行β折疊鏈與一股環(huán)形肽鏈連接而成。β拱形：由位于不同層面內(nèi)相對(duì)的兩條β折疊鏈共價(jià)連接一個(gè)環(huán)拱結(jié)構(gòu)組成。β-α-β模體：由兩個(gè)相鄰的平行β折疊通過(guò)一定長(zhǎng)度的α螺旋連接在一起α-α模體：一個(gè)蛋白質(zhì)分子可包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域的核心由模體組成。一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)，除一級(jí)結(jié)構(gòu)，特異折疊的空間結(jié)構(gòu)形式的形成尚需分子伴侶（chaperone）存在及適當(dāng)?shù)娜芤涵h(huán)境。2、蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)一個(gè)蛋白質(zhì)分子與其配體之間的結(jié)合需要在兩個(gè)分子的特定部位之間形成很多弱化學(xué)鍵，兩分子間相互作用的部位稱為結(jié)合位點(diǎn)。僅僅屬于多肽鏈的一小部分，其余的氨基酸殘基為維持正確的空間位置所必需。3、蛋白質(zhì)之間相互作用的特異性由其結(jié)合位點(diǎn)決定。兩分子的結(jié)合位點(diǎn)必需存在能夠配對(duì)形成非共價(jià)鍵的基團(tuán)，而且每對(duì)基團(tuán)在空間上恰好能達(dá)到形成非共價(jià)鍵的最佳距離。信號(hào)傳遞過(guò)程中，正是通過(guò)蛋白質(zhì)分子之間相互作用的特異性而保證信號(hào)傳遞的特異性。DNA-蛋白質(zhì)相互作用（DNA-proteininteraction）一、DNA-蛋白質(zhì)相互作用的化學(xué)鍵1、氫鍵:具有識(shí)別功能蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)常與DNA的大溝相互作用。2、疏水鍵：暴露于大溝側(cè)緣的T-CH3基團(tuán)是疏水性的，可與疏水氨基酸殘基側(cè)鏈相互作用。3、離子鍵：二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用中的序列特異性1、序列特異識(shí)別的結(jié)合能：依賴兩種類(lèi)型的相互作用。一是多肽鏈與DNA大溝暴露的堿基之間通過(guò)氫鍵和范德華力建立的聯(lián)系；二是多肽鏈中的堿性氨基酸與戊糖-磷酸骨架之間的電荷聯(lián)系。2、序列特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)基元：螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helixHTH），鋅指結(jié)構(gòu)（zincfingermotif）HTHHTH基元：最初發(fā)現(xiàn)于λ噬菌體的阻遏蛋白中，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在很多原核及真核DNA結(jié)合蛋白中存在。由兩個(gè)較短的α螺旋與其間含Gly殘基的絞鏈組成。如大腸桿菌的CAP蛋白含一HTH結(jié)構(gòu)域，HTH通過(guò)DNA雙螺旋大溝識(shí)別、結(jié)合反向重復(fù)序列TGTG/CACA。鋅指結(jié)構(gòu)首先發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞純化的TFⅢA，它是5SrRNA基因轉(zhuǎn)錄激活因子，結(jié)合50bp5SrRNA編碼基因的內(nèi)調(diào)控區(qū)。含有9個(gè)相同的鋅指結(jié)構(gòu)。TranslationTranslationinprokaryotes蛋白質(zhì)生物合成體系氨基酸的活化與搬運(yùn)核糖體循環(huán)多聚核糖體TranslationineukaryotesPosttranslationalprocessing蛋白質(zhì)生物合成體系1、mRNA2、核糖體3、tRNA4、起始因子、延長(zhǎng)因子和終止因子5、氨基酰-tRNA合成酶mRNA：模板遺傳密碼(geneticcodon)：三聯(lián)體密碼（tripletcode)遺傳密碼的破譯：遺傳密碼表遺傳密碼的特點(diǎn)：連續(xù)性(commaless)有起始密碼(AUG)和終止密碼(UAA,UAG,UGA)簡(jiǎn)并性(degeneracy)擺動(dòng)性(wobble)通用性(universal)mRNA(messengerRNA)是翻譯的直接模板實(shí)驗(yàn)1：系統(tǒng)中加入RNase，蛋白質(zhì)合成立刻終止；實(shí)驗(yàn)2：系統(tǒng)中加入DNase，蛋白質(zhì)合成在30分鐘后終止。說(shuō)明：蛋白質(zhì)合成是以RNA為模板；而RNA合成又是以DNA

為模板的。DNARNA前體成熟mRNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄加工運(yùn)輸翻譯細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)三聯(lián)體密碼（tripletcode)mRNA5′AUCGACCUGAGC3′420(×)42=1620(×)43=6420(√)mRNA5′AUCGACCUGAGC3′mRNA5′AUCGACCUGAGC3′mRNA5‘UUUUUUUUUUUU3‘多肽NPhe-Phe-Phe-PheC密碼子與反密碼子配對(duì)的擺動(dòng)現(xiàn)象tRNA反密碼子堿基IUCmRNA密碼子堿基A,C,UA,GC,G,U核糖體（ribosome)：場(chǎng)所1、有容納mRNA的通道2、能結(jié)合起始、延長(zhǎng)及終止因子等。3、有A位（acceptorsite)和P位(donorsite).4、有轉(zhuǎn)肽酶活性，催化肽鍵形成5、大亞基上有延長(zhǎng)因子依賴的GTP酶活性，可為轉(zhuǎn)肽提供能量。tRNA：接合器一種tRNA只能與一種氨基酸結(jié)合，一種氨基酸可與幾種tRNA結(jié)合。結(jié)合位點(diǎn)為：3`端CCA-OH。Ala-tRNAala;met-tRNAemet;攜帶延長(zhǎng)中的肽鏈上的蛋氨酸fmet-tRNAfmet：起始tRNA(原核生物）Met-tRNAimet接頭假說(shuō)：起始因子（initiationfactor)

參與蛋白質(zhì)起始復(fù)合物的形成。IF-1：促進(jìn)IF-2和IF-3的活化。IF-2：促進(jìn)fmet-tRNAfmet與30S小亞基結(jié)合的作用，并有依賴核糖體的GTP酶活。IF-3：使30S亞基釋放，輔助mRNA與小亞基結(jié)合，并阻止大小亞基重新聚合。延長(zhǎng)因子(elongationfactor)EF-Tu:與氨酰-tRNA及GTP結(jié)合形成EF-Tu.GTP.AA-tRNA，將氨酰tRNA轉(zhuǎn)入A位。EF-Ts：在GTP供能時(shí)，使EF-Tu.GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镋F-Tu.GTP.EF-G：依賴于核糖體的GTPase，使GTP水解，并有移位酶作用。終止因子(terminationfactor

又稱為釋放因子(releasefactor,RF)功能是識(shí)別mRNA上的終止密碼子,終止肽鏈的合成并釋放出肽鏈。RF-1:識(shí)別密碼子UAA及UAGRF-2:UAA及UGARF-3:結(jié)合GTP,并促進(jìn)RF-1及RF-2與核糖體的結(jié)合。氨基酰-tRNA合成酶既能識(shí)別特定的氨基酸，又能識(shí)別轉(zhuǎn)運(yùn)該氨基酸的tRNA。氨基酸+ATP+tRNA氨基酰-tRNA+AMP+PPi氨基酰-tRNA合成酶可發(fā)揮較對(duì)功能，使誤載的氨基酰-tRNA從tRNA上釋下，保證遺傳信息翻譯的準(zhǔn)確性。核糖體循環(huán)（ribosomecycle)起始（initiation)延長(zhǎng)(elongation)終止（termination)起始（initiation)

1、核糖體大小亞基的解離：IF-3、IF-12、mRNA與小亞基結(jié)合。AUG上游8~13個(gè)堿基處存在SD序列（Shine-Dalgarnosequence),能與小亞基中16SrRNA3`端序列互補(bǔ)。3、fmet-tRNA的結(jié)合：IF-2、GTP、IF-14、大亞基結(jié)合：IF-2有GTP酶活，各IF釋放。延長(zhǎng)(elongation)

進(jìn)位（注冊(cè)）：先形成EF-Tu.GTP.AA-tRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)肽肽酰轉(zhuǎn)移酶，不需GTP，位于大亞基，中心含23SrRNA。移位

EF-G，GTP供能。終止（termination)

RF核糖體轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)樗饷富钚?。多聚核糖體（polyribosome)在一條mRNA鏈上常結(jié)合有多個(gè)核糖體，呈串珠狀排列，同時(shí)進(jìn)行多肽鏈的合成。每個(gè)獨(dú)立的核糖體都能合成一條完整的多肽鏈，因此從同一模板上同時(shí)能合成多條多肽鏈?？商岣適RNA的利用率和蛋白質(zhì)生物合成的速度。真核生物蛋白質(zhì)合成的特點(diǎn)起始階段（1）在核內(nèi)合成mRNA前體，加工并與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白顆粒，轉(zhuǎn)入胞漿。起始時(shí)其二級(jí)結(jié)構(gòu)需要松解，并放出多余的蛋白質(zhì)。（2）Met-tRNAiMet（3）起始復(fù)合物：40S-mRNA-Met-tRNAiMet（4）沒(méi)有SD序列。帽子結(jié)合蛋白結(jié)合mRNA上的帽子結(jié)構(gòu)。（5）至少9種起始因子。eIF-2：GTP結(jié)合蛋白，與GTP結(jié)合后攜帶起始Met-tRNAiMet進(jìn)入40S小亞基。eIF-4A：ATPase，eIF-4B：解鏈酶，松解mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)eIF-4E：帽結(jié)合蛋白（cap-bindingprotein,CBP)eIF-4F:通過(guò)eIF-4E與mRNA的5`帽結(jié)構(gòu)結(jié)合，eIF-3參與尋找AUG。延長(zhǎng)、終止階段延長(zhǎng)：僅延長(zhǎng)因子不同

eEF-1α相當(dāng)于EF-TueEF-1β相當(dāng)于EF-TseEF-2相當(dāng)于EF-G。終止：僅一種釋放因子，可識(shí)別3種密碼子（UAA、UAG、UGA），并需GTP。肽鏈的翻譯后加工新生肽鏈的折疊肽鏈中氨基酸的共價(jià)修飾糖苷共價(jià)修飾（covalentmodification)脂質(zhì)共價(jià)修飾其它共價(jià)修飾新生肽鏈的水解修飾亞單位聚合新生肽鏈的折疊折疊酶(foldase)或分子伴侶(molecularchaperone)分子伴侶:是一個(gè)結(jié)構(gòu)上互不相同的蛋白質(zhì)家族,可識(shí)別肽鏈的非天然構(gòu)象,促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊。如熱休克蛋白（heatshockprotein,HSP)70與60。肽鏈中氨基酸的共價(jià)修飾糖苷共價(jià)修飾（covalentmodification)：多肽鏈的糖苷化與肽鏈的合成同時(shí)進(jìn)行。脂質(zhì)共價(jià)修飾：脂肪酸與多肽鏈中的絲、蘇氨酸的羥基以酯鍵結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的生物功能。其它共價(jià)修飾：羥基化、磷酸化、甲基化、乙?；取Ｐ律逆湹乃庑揎椀鞍踪|(zhì)生物合成的抑制利福霉素及其衍生物利福平：與原核細(xì)胞RNA聚合酶的亞基結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄?？咕?。白喉毒素（diphtheriatoxin)對(duì)真核生物劇毒，實(shí)質(zhì)是一種修飾酶，對(duì)真核生物的EF-2起共價(jià)修飾作用，使其失活。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)白喉毒素比正常細(xì)胞更敏感，故用它與抗腫瘤細(xì)胞的特異抗原結(jié)合以消滅腫瘤細(xì)胞。干擾素（interferon)由真核生物細(xì)胞感染病毒后分泌的具有抗病毒作用的蛋白質(zhì)?？梢种撇《痉敝常Ｗo(hù)宿主。干擾素在雙鏈RNA（某些RNA病毒）存在時(shí)，作用于蛋白質(zhì)合成的啟動(dòng)階段，使蛋白質(zhì)合成受抑制。干擾素還可誘導(dǎo)生成一種寡核苷酸，活化RNaseL，由RNaseL降解病毒RNA。作業(yè)核酶反義RNAHIV病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能端粒與端粒酶RFLP人類(lèi)基因組多樣性計(jì)劃常用抗生素的作用機(jī)制談?wù)勀銓?duì)《分子生物學(xué)》的認(rèn)識(shí)Chapter4replicationDNAreplicationDNAdamageandrepairReversetranscriptionRNAreplicationDNA復(fù)制的基本特點(diǎn)半保留復(fù)制（self-conservativereplication）復(fù)制子（replicon)半保留復(fù)制1958年，Meselson和Stahl首次用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制。步驟：用普通培養(yǎng)基（14N）培養(yǎng)15N標(biāo)記的大腸桿菌。用CsCl密度梯度離心法分析DNA。加熱子一代DNA分子。復(fù)制子（replicon)復(fù)制子:基因組中能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制的單位。每個(gè)起始點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)復(fù)制子。起始點(diǎn)（originofreplication,ori):原核生物DNA分子中只有一個(gè)，長(zhǎng)度200bp左右。大腸桿菌oriC有245bp。真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。終點(diǎn)（ter）：D、A、C、B（23bp共有序列）Tus（terminatorutilizationsubstance）識(shí)別終止序列。復(fù)制的方向：?jiǎn)蜗蚧螂p向原核生物DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)1958年Kornberg首先從大腸桿菌提取DNApolⅠ：聚合作用：5`→3`3`→5`外切酶活性：校對(duì)功能5`→3`外切酶活性：引物切除、損傷修復(fù)主要功能是切除引物，填補(bǔ)岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復(fù)DNApolⅠ是單一肽鏈的大分子,分子量為109kD,二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。用特異的蛋白酶處理，可把DNApolⅠ水解為兩個(gè)片段，即在F，G螺旋之間發(fā)生斷裂。小片段：323個(gè)氨基酸殘基，5`→3`外切酶活性大片段或稱Klenow片段：604個(gè)氨基酸殘基，DNA聚合酶活性和3`→5`外切酶活性DNApolⅡ：5`→3`聚合酶活性及3`→5`外切核酸酶活性。DNApolⅢ:由10個(gè)亞基組成，分別為α、ε、θ、τ、δ、δ`、β、κ及ψ。是原核生物體內(nèi)真正起復(fù)制作用的酶。α亞基：5`→3`聚合酶活性ε亞基：3`→5`外切酶,校對(duì)和編輯θ為裝配必須大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ真核生物DNA聚合酶α、β、γ及δ四種，都有5`→3`聚合功能。α及δ參與核DNA復(fù)制；

α：鏈合成的引發(fā)，δ：鏈的延長(zhǎng)

polδ；切除引物后填補(bǔ)空隙

β：外切核酸酶

γ：線粒體DNA復(fù)制其它環(huán)狀DNA分子的復(fù)制

1、θ復(fù)制:首先由J.Carins從大腸桿菌中觀察到,又稱為Carins復(fù)制。2、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication)3、D環(huán)復(fù)制（Dloopreplication)：線粒體DNA復(fù)制端粒與端粒酶(telomerase)

Telomere:真核生物線性染色體3末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。核苷酸重復(fù)序列富含G，和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列，長(zhǎng)度5~15kb。作用：保護(hù)染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解；解決染色體復(fù)制時(shí)末端丟失問(wèn)題。

Telomerase:由RNA和蛋白質(zhì)組成的酶。兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用。1995年，JunliFeng等克隆了人類(lèi)端粒酶RNA基因，長(zhǎng)約450個(gè)堿基的RNA序列中有一段長(zhǎng)11個(gè)核苷酸的區(qū)域（5-CUAACCCUAAC-3）與人的端粒序列（TTAGGG）n互補(bǔ)。端粒酶蛋白質(zhì)的分離：四膜蟲(chóng)端粒酶兩個(gè)多肽成分p80和p95。端粒與衰老實(shí)驗(yàn)：在無(wú)端粒酶活性的成纖維細(xì)胞中表達(dá)端粒酶時(shí)，端粒的縮短和細(xì)胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細(xì)胞的衰老是由端粒驅(qū)動(dòng)的。體外培養(yǎng)的細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度隨細(xì)胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對(duì)染色體的保護(hù)作用。細(xì)胞隨之發(fā)生衰老和死亡?？砂讯肆？闯梢幻骁姡肆５拈L(zhǎng)度是鐘上的刻度，記載了細(xì)胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘或“生命的時(shí)鐘”，可通過(guò)測(cè)定端粒的長(zhǎng)度預(yù)測(cè)細(xì)胞的壽命。胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度并不隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無(wú)限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。端粒酶與腫瘤人體內(nèi)除了生殖細(xì)胞和少數(shù)一些體細(xì)胞如淋巴細(xì)胞等細(xì)胞外，絕大多數(shù)體細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中能檢測(cè)到端粒酶的活性。腫瘤的端粒長(zhǎng)度很短，其繼續(xù)縮短導(dǎo)致染色體融合、細(xì)胞死亡，而端粒酶的激活可以維持端粒的長(zhǎng)度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達(dá)可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。端粒酶與惡性腫瘤之間有相關(guān)性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標(biāo)?？梢酝ㄟ^(guò)各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription)逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復(fù)制過(guò)程乙肝病毒基因組的復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription)

1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過(guò)程中要合成DNA。Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，但不能抑制一般RNA病毒的復(fù)制。表明：轉(zhuǎn)錄對(duì)于RNA病毒增殖是必需的。Temin提出前病毒假說(shuō)：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌中的中間物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。多功能酶：1、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：合成互補(bǔ)DNA。4、沒(méi)有3`→5`外切酶活性。特點(diǎn)：含有Zn2+DNA合成反應(yīng)要求有模板和引物。需適當(dāng)濃度的二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+、Mn2+）5’→3’→逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因

組復(fù)制過(guò)程第一階段：合成負(fù)股cDNA的大部分第二階段：以負(fù)股DNA為模板合成一小部分正股DNA鏈。第三階段：完成cDNA的全部復(fù)制。乙肝病毒基因組的復(fù)制其復(fù)制需通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程經(jīng)RNA中間體實(shí)現(xiàn)，其DNA聚合酶也是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA試管內(nèi)cDNA的合成常用于獲得或研究真核生物基因的方法。提取某一種特定的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：來(lái)自鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒稱為AMV-RT；來(lái)自鼠白血病毒稱為MMLV-RT。病毒RNA復(fù)制的主要方式1、病毒含有正鏈RNA，如灰質(zhì)炎病毒。RNA（+）→蛋白質(zhì)（酶）→RNA復(fù)制2、病毒含有負(fù)鏈RNA和復(fù)制酶如狂犬病毒。RNA（—）→RNA（+）→蛋白質(zhì)、復(fù)制病毒RNA。3、病毒含有雙鏈RNA和復(fù)制酶。如呼腸孤。雙鏈RNA→RNA（+）→蛋白質(zhì)→RNA（—）→雙鏈RNA4、逆轉(zhuǎn)錄病毒。討論題如何知道DNA復(fù)制中先要有RNA引物的合成？原料新合成DNA序列分析專一核酸酶水解某種病毒DNA的堿基組成（摩爾百分比）如下：

A=32；G=16；T=40；C=12

該病毒DNA的特點(diǎn)如何？簡(jiǎn)要說(shuō)明怎樣進(jìn)行構(gòu)建cDNA文庫(kù)？組織培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞S期長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)，經(jīng)放射自顯影測(cè)定DNA復(fù)制的速度是0.5微米/分，已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA全長(zhǎng)1.2米，計(jì)算染色體復(fù)制時(shí)共有多少?gòu)?fù)制叉在復(fù)制？8×103已知抹香鯨和豬的胰島素具有相同的氨基酸序列，然而某些抗血清卻能將它們區(qū)別開(kāi)來(lái)，這豈不與“蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)”的理論相矛盾嗎？你如何解釋？將某種純蛋白1mg進(jìn)行氨基酸分析，得19.5ug的異亮氨酸（分子量=131.2），那么該蛋白質(zhì)的最小分子量是多少？質(zhì)粒DNA的提取與純化1、細(xì)菌的培養(yǎng)2、細(xì)菌的收集與裂解3、質(zhì)粒DNA的純化：堿裂解法原理：在pH12.0~12.6的堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體變性，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)2023/12/28195核酸的體外擴(kuò)增2023/12/28196第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreactionPCR2023/12/28197一、PCR的基本原理PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右2023/12/281982023/12/28199二、PCR引物設(shè)計(jì)一對(duì)引物，與3′端互補(bǔ)長(zhǎng)度：15～30個(gè)核苷酸堿基分布隨機(jī)引物內(nèi)、引物間不應(yīng)有互補(bǔ)序列引物與非特異擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源性3′端必須互補(bǔ)5′端可游離2023/12/28200三、模板的制備DNA從細(xì)胞中提取DNA：血細(xì)胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、精斑、口腔上皮細(xì)胞固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化RNA新鮮組織或細(xì)胞所用器皿和試劑必需經(jīng)高溫滅菌或DEPC處理2023/12/28201四、PCR的基本反應(yīng)

（一）、以DNA為模板的反應(yīng)：10×緩沖液10l

4種dNTP混合物各200

mol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2

g

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100l

2023/12/28202PCR反應(yīng)五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+TaqDNA聚合酶來(lái)自水生棲熱菌Thermusaquaticus良好的耐熱性Mg2+依賴性無(wú)校正功能2023/12/28203（二）、以mRNA為模板的反應(yīng)mRNA5l5×Buffer4ldNTP2l(10mmol/L)RNasin1l(20u)AMVRTase1l(10u)Oligo(dT)12—18(或下游引物)1lddH2O6l/20l42℃水浴1小時(shí)，95℃水浴10分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。向上述反應(yīng)體系中添加如下試劑：2023/12/2820410×Buffer5l25mmol/LMg2+

3lTaq酶0.5l（2.5u）上游引物1lddH2O20.5l/50l按PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行RT--PCR2023/12/28205（三）PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)形式（2n），隨著目的DNA的積累，在引物—模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和—平臺(tái)期。（25個(gè)循環(huán)）（四）PCR反應(yīng)的自動(dòng)化2023/12/28206五、PCR反應(yīng)條件的控制（一）PCR反應(yīng)的緩沖溶液提供合適的酸堿度和某些離子10～50mmol/LTris-HCl緩沖液50mmol/LKClBSA或明膠（二）鎂離子濃度Taq酶活性需要Mg2+，Mg2+濃度過(guò)高導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。一般常用1.5mmol/L2023/12/28207（三）底物濃度dNTP濃度在20～200mol/L四種dNTP必須濃度相等（四）Taq

DNA聚合酶Taq

DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活性2023/12/28208（五）引物引物濃度一般為0.1～0.5mol/L（六）反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時(shí)間95℃/30～60s退火溫度和時(shí)間45～55℃/30～60s延伸溫度和時(shí)間72℃循環(huán)次數(shù)25～30不超過(guò)352023/12/28209六、PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)PCR反應(yīng)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題：假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶假陽(yáng)性出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶2023/12/28210（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開(kāi)，無(wú)菌操作（二）設(shè)立對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分注意的事項(xiàng)：2023/12/28211七、PCR技術(shù)的主要類(lèi)型㈠筑巢PCR㈥彩色PCR㈡多重PCR㈦原位PCR㈢不對(duì)稱PCR㈧定量PCR㈣共享引物PCR㈨差異顯示PCR㈤錨定PCR㈩重組PCR2023/12/28212PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(

g=-6)水平簡(jiǎn)便、快速：PCR反應(yīng)一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。2023/12/282134.對(duì)標(biāo)本的純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。2023/12/28214第二節(jié)連接酶鏈反應(yīng)LigasechainreactionLCR2023/12/28215一、LCR的基本原理LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5′磷酸與另一相鄰鏈的3′羥基連接為基礎(chǔ)的循環(huán)反應(yīng)。2023/12/282162023/12/28217二、LCR產(chǎn)物的檢測(cè)標(biāo)記引物：放射性標(biāo)記熒光素標(biāo)記地高辛標(biāo)記2023/12/28218三、影響LCR的重要因素㈠引物基因的突變位點(diǎn)長(zhǎng)度足夠㈡LCR的反應(yīng)條件2023/12/28219第三節(jié)RNA的體外擴(kuò)增

RNA—PCR2023/12/28220轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(transcript-basedamplificationsystem,TAS)自主維持序列擴(kuò)增或再生式序列復(fù)制（self-sustainedsequencereplication,3SR)核酸序列的擴(kuò)增（nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA）2023/12/28221

一、基本原理以RNA為模板在體外大量擴(kuò)增RNA非循環(huán)相逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄循環(huán)相聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)體系溫度均一RNA產(chǎn)物以10的指數(shù)方式增加2023/12/282222023/12/28223酶：逆轉(zhuǎn)錄酶，RNaseH,T7RNA聚合酶引物：引物A—與RNA3′端互補(bǔ)，5′端含啟動(dòng)子引物B—與cDNA第一條鏈3′端互補(bǔ)底物：dNTP,NTP模板：緩沖液：RNA—PCR反應(yīng)體系的組成2023/12/28224二、產(chǎn)物的檢測(cè)三、RNA—PCR技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用特點(diǎn)：擴(kuò)增效率極高特異性強(qiáng)應(yīng)用：檢測(cè)RNA，RNA測(cè)序，臨床診斷真核表達(dá)體系轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣沉淀DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；人造膜顯微注射篩選標(biāo)志

tk-NeorG418瞬時(shí)轉(zhuǎn)染目的基因不整合進(jìn)宿主基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因整合進(jìn)宿主基因組tk-

細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞胸苷激酶（tk）TTP：從頭合成（氨甲喋呤阻斷），補(bǔ)救合成HAT選擇（H：次黃嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷）tk+：生長(zhǎng)tk-+帶tk基因的質(zhì)粒：生長(zhǎng)藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞neor新霉素：細(xì)菌抗生素，干擾原核生物蛋白質(zhì)合成G418：干擾原核、真核生物neo：磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418失活neo與目的基因連鎖,轉(zhuǎn)染目的基因的定點(diǎn)誘變及其應(yīng)用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)基因定點(diǎn)誘變技術(shù)的應(yīng)用長(zhǎng)效胰島素、快速吸收胰島素基因克隆的改建堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGH）：牛源性→人源性，2個(gè)核苷酸的差異第九章DNA序列測(cè)定末端終止法--待測(cè)單鏈DNA模板引物四種dNTP(其中一種用32P/35S標(biāo)記)終止劑(ddNTP)DNA聚合酶

Sanger發(fā)明：兩次獲得諾貝爾獎(jiǎng)

分別得到ddAddTddGddC結(jié)尾的片段測(cè)序過(guò)程:1.模板與引物雜交2.引物的延長(zhǎng)和合成阻斷四個(gè)試管分別加入DNA聚合酶dNTP標(biāo)記底物終止劑不同ddAddGddCddT四個(gè)試管中所有產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的聚合鏈3.電泳ACGT次序高壓電泳4.放射自顯影得到直讀圖象第十章核酸分子雜交技術(shù)概念：具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。探針待測(cè)核酸雜交分子核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交的基本方法探針的標(biāo)記核酸分子雜交的基本原理DNA變性方法熱變性：90~100℃酸堿變性：常采用堿變性化學(xué)試劑變性：尿素、甲酰胺、甲醛等特點(diǎn)：粘度增加、密度增加、增色效應(yīng)、溶解溫度(meltingtemperature,Tm)DNA復(fù)性或雜交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等影響雜交的因素核酸分子的濃度和長(zhǎng)度濃度大，復(fù)性快；分子量大，復(fù)性慢溫度離子強(qiáng)度雜交液中的甲酰胺核酸分子的復(fù)雜性非特異性雜交反應(yīng)預(yù)雜交：封閉非特異性雜交位點(diǎn)，用鮭魚(yú)精子DNA分子雜交的基本方法Southern印跡法Northern印跡法斑點(diǎn)印跡雜交原位雜交Western印跡法液相雜交

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

Southern印跡雜交1975年，英國(guó)Southern創(chuàng)建DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。Southern雜交(Southernbloting)的主要步驟待測(cè)DNA樣品的制備、酶切待測(cè)DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備

Southern雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)Northern印跡雜交(Northernbloting)檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性斑點(diǎn)印跡雜交(dotbloting)將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品原位雜交(insituhybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)核酸原位雜交的基本步驟細(xì)胞或組織的固定：載玻片組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)記雜交雜交結(jié)果檢測(cè)Western

雜交印跡法(Westernbloting)檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：NC膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)液相雜交核酸分子與核酸探針存在于雜交液中RNA酶保護(hù)分析法核酸酶S1保護(hù)分析法探針的標(biāo)記探針的種類(lèi)cDNA探針、基因組DNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針標(biāo)記物核素標(biāo)記物（同位素標(biāo)記）：32P、35S、3H等非核素標(biāo)記物（非同位素標(biāo)記）：生物素、地高辛、熒光素等探針標(biāo)記方法缺口平移法(nicktranslation)隨機(jī)引物法(randomprimer)：六核苷酸殘基的引物PCR標(biāo)記法末端標(biāo)記法探針的純化Chapter2Structures&functionsofnucleicacid&protein

Nucleicacids

DNAStructures&functionsRNAStructures&functions

ProteinsInteractionbetweenbiopolymer

protein-proteininteractionDNA-proteininteraction第一節(jié)核酸生物大分子（biopolymer）

:

nucleicacid、protein、polysaccharose（多糖）。分子量：10~103kD一級(jí)結(jié)構(gòu)：基本結(jié)構(gòu)單位的排列順序。

nucleicacid：

DNA（deoxyribonucleicacid）

RNA（ribonucleicacid）DNAStructures&functions

Primarystructure：DNA分子中核苷酸的排列順序。Secondarystructure：雙螺旋（doublehelix）三股螺旋（triplehelix）Tertiarystructure：超螺旋（supercoil）DNAprimarystructure

&function一級(jí)結(jié)構(gòu)的基本特點(diǎn)：

兩類(lèi)核酸分子的組成比較嘌呤嘧啶核糖磷酸DNAA，GC，T脫氧核糖磷酸RNAA，GC，U核糖磷酸5’末端的磷酸基團(tuán)3‘，5’-磷酸二酯鍵3‘末端羥基DNA攜帶的遺傳信息

※有功能活性的DNA序列所攜帶的遺傳信息。

※調(diào)控信息：能被各種蛋白質(zhì)分子特異性識(shí)別和結(jié)合。DNA的甲基化（MythylationofDNA）原核生物：多為對(duì)一些酶切位點(diǎn)的修飾，作用是對(duì)自身DNA產(chǎn)生保護(hù)作用。真核生物：在基因表達(dá)調(diào)控中起主要作用。DNASecondaryStructures&functions

1、雙螺旋結(jié)構(gòu)（doublehelix）三股螺旋DNA（triplehelix）三鏈DNA（triplestrandsDNA，tsDNA）1957年由Felesnfeld及Davis首先發(fā)現(xiàn)。三條鏈均為同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy）。兩種基本類(lèi)型：

Pu-Pu-Py型：在堿性介質(zhì)中穩(wěn)定。

Py-Pu-Py型：在偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定。三鏈DNA既可以是B-DNA與另一條DNA鏈結(jié)合成的鏈間的三鏈DNA，又可以是B-DNA與其自身的一條鏈結(jié)合形成的鏈內(nèi)的三鏈DNA。分子內(nèi)三鏈DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中發(fā)現(xiàn)。其形成要求雙螺旋中存在連續(xù)的嘌呤或嘧啶序列，而且必須是鏡像重復(fù)序列。

鏡像重復(fù)序列：由反方向完全相同的兩個(gè)序列組成。5′GGAATCGATCTTTTCTAGCTAAGG3′3′CCTTAGCTAGAAAAGATCGATTCC3′反轉(zhuǎn)重復(fù)（invertedrepeated)：由反方向互補(bǔ)的兩個(gè)DNA片段組成，兩個(gè)反轉(zhuǎn)重復(fù)序列又叫回文序列(palindromesequence)。鏡像重復(fù)(mirrorrepeat)：由反方向完全相同的兩個(gè)序列組成。直接重復(fù)(directrepeat)：由同一方向完全相同的兩個(gè)序列組成。正向重復(fù)序列、順向重復(fù)序列。DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)——超螺旋（supercoil）

生物體閉環(huán)DNA都以超螺旋形式存在，如細(xì)菌質(zhì)粒、病毒、線粒體DNA。線性DNA分子或環(huán)狀DNA分子中有一條鏈有缺口時(shí)不能形成超螺旋。超螺旋的意義：緊密，體積更?。荒苡绊戨p螺旋的解鏈程序，因而影響DNA分子與其它分子之間的相互作用。真核生物染色體三級(jí)結(jié)構(gòu)：RNAStructures&functions

一、mRNA：messengerRNA二、tRNA：transferRNA三、rRNA：ribosomalRNA四、核酶（ribozyme）五、核內(nèi)不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA）六、小分子核內(nèi)RNA（smallnuclearRNA，snRNA）七、反義RNA（antisenseRNA）mRNA

原核生物mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、多順?lè)醋樱╬olycistron）:一分子mRNA帶有幾種蛋白質(zhì)的遺傳信息，可以作為幾種蛋白質(zhì)的模板，能翻譯出幾種蛋白質(zhì)。2、mRNA5′端無(wú)帽子結(jié)構(gòu),3′端一般無(wú)多聚A的尾巴。3、一般沒(méi)有修飾堿基。每種順?lè)醋邮且粋€(gè)特異的翻譯區(qū)；每個(gè)翻譯區(qū)與核蛋白體之間有一個(gè)獨(dú)立的結(jié)合部位；各個(gè)翻譯區(qū)之間借一段無(wú)編碼功能的核苷酸序列相連，5′端、3′端也有非編碼區(qū)。真核生物mRNA結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)1、5′末端有帽子結(jié)構(gòu)。2、3′端多數(shù)帶有多聚A的尾巴(polyadenylatetail),其長(zhǎng)度為20~200個(gè)A.3、分子中可能有修飾堿基,主要是甲基化.4、分子中有編碼區(qū)與非編碼區(qū)。非編碼區(qū)（untranslatedregionUTR）位于編碼區(qū)的兩端；5′非編碼區(qū)有翻譯起始信號(hào)。tRNA：轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸1、單鏈小分子，含73~93個(gè)核苷酸。2、含有很多稀有堿基或修飾堿基。多為甲基化。3、5′端總是磷酸化，且常是pG。4、3′端為CCAOH。5、二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草形。6、三級(jí)結(jié)構(gòu)為倒L型。rRNA原核生物真核生物核糖體70S80S小亞基30S40SrRNA16S(1542個(gè)核苷酸)18S（1874個(gè)核苷酸）蛋白質(zhì)21種(占總重量的40%)33種（占總重量的50%）大亞基50S60SrRNA23S(2940個(gè)核苷酸)28S（4718個(gè)核苷酸）5S(120個(gè)核苷酸)5.85S(160個(gè)核苷酸)5S(120個(gè)核苷酸)蛋白質(zhì)31種(占總重量的30%)49種(占總重量的35%)核糖體的組成原核生物16SrRNA3′端有一保守序列ACCUCCU，是mRNA的識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)。原核生物5SrRNA43~47位核苷酸為CGAAC序列，可與tRNA上GTΨCG互補(bǔ)。真核生物5.8SrRNA上也有相同的CGAAC序列,是tRNA與rRNA相互識(shí)別、相互作用的部位。rRNA上有許多rRNA之間識(shí)別結(jié)合部位及蛋白質(zhì)的相互作用部位。核酶：有催化活性的RNA1982年，美國(guó)ThomasCech在研究四膜蟲(chóng)rRNA自我剪接時(shí)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)加拿大的SidneyAltman發(fā)現(xiàn)RNaseP分子中的RNA組分有催化活性；1989年分享了Noble化學(xué)獎(jiǎng)。不僅拓寬了生物催化劑的領(lǐng)域，而且對(duì)RNA的生物學(xué)功能開(kāi)創(chuàng)了一種歷史性的新認(rèn)識(shí)：RNA不僅具有儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的功能，而且還具有生物催化劑的功能，在一定程度上可以說(shuō)，RNA一身兼有DNA和蛋白質(zhì)兩大類(lèi)生物大分子的功能。核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于催化活性很重要。Symons提出“錘頭”（hammerhead）狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。三個(gè)螺旋區(qū)；13（或11）個(gè)保守核苷酸序列。核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄生成mRNA的前體。加工過(guò)程包括：5′加帽；3′端加尾；內(nèi)含子的切除和外顯子的拼接；分子內(nèi)部的甲基化修飾作用；核苷酸序列的編輯作用。小分子核內(nèi)RNA(snRNA)真核細(xì)胞核內(nèi)一組小分子RNA,含70~300堿基,序列中尿嘧啶含量較高,因此又用U命名.既非任何RNA的前體,也非某種RNA代謝的中間產(chǎn)物,而是具有獨(dú)特功能且獨(dú)立存在的實(shí)體,參與mRNA的加工。常與多種特異的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，形成小分子核內(nèi)核蛋白顆粒（smallnuclearribonucleoproteinparticle，snRNP）反義RNA堿基序列正好與有意義mRNA互補(bǔ)的RNA，又稱為調(diào)節(jié)RNA。可與mRNA配對(duì)結(jié)合形成雙鏈，最終抑制mRNA作為模板進(jìn)行翻譯。還可作為DNA復(fù)制的抑制因子，與引物RNA互補(bǔ)結(jié)合抑制DNA復(fù)制，及在轉(zhuǎn)錄水平上與mRNA5′端互補(bǔ)，阻止RNA合成轉(zhuǎn)錄?？梢匀斯ず铣煞戳xRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá),用于疾病治療。原核生物中也有一種mRNA干擾互補(bǔ)RNA（MrnainterferingcomplementaryRNA，micRNA），也可與特異mRNA結(jié)合并阻止翻譯。核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，更有效去除蛋白質(zhì)。氯仿還可加速有機(jī)相與水相的分層。異戊醇：抑制界面泡沫的形成。標(biāo)準(zhǔn)程序：酚——酚-氯仿——氯仿。核酸的沉淀原理：核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶，也不會(huì)變性。醋酸鈉為沉淀DNA、RNA的最常用鹽類(lèi)。有機(jī)溶劑：乙醇、異丙醇、聚乙二醇。溫度：冰水真核細(xì)胞RNA的提取純化一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA，其中80~85%為rRNA，mRNA為細(xì)胞總RNA的1~5%。制備高質(zhì)量真核細(xì)胞RNA的關(guān)鍵是在抽提的最初步驟就需要抑制核糖核酸酶的活性，并避免所