微生物限度檢查及控制

微生物限制檢驗(yàn)及控制王旭2021教程目的GMP檢查中常見(jiàn)的缺陷微生物限制檢查的定義微生物限制檢查的樣品處置微生物限制檢查用培育基及其靈敏度檢查微生物限制檢查方法和驗(yàn)證1－GMP檢查中常見(jiàn)的缺陷XXX止咳糖漿中含有防腐劑，但廢品的微生物限制檢驗(yàn)操作規(guī)程未嚴(yán)厲按照2000年版<中國(guó)藥典>的要求制定，未思索到防腐劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，檢驗(yàn)方法不合理。純化水微生物限制檢測(cè)方法未驗(yàn)證，實(shí)踐檢測(cè)方法不合理，樣品被稀釋了1660倍后再用直接接種法進(jìn)展檢測(cè)。微生物限制檢查的原始記錄短少所用培育基的稱(chēng)號(hào)、配制批號(hào)。注射用水、純化水檢測(cè)中，未按2005版藥典要求進(jìn)展霉菌和酵母菌數(shù)的檢驗(yàn)。2.定義測(cè)定一切藥用資料〔從原料到廢品〕中需氧微生物的數(shù)量的方法。證明一切藥用資料〔從原料到廢品〕中無(wú)特定微生物的方法。3.取樣及樣品處置我們期望什么?在整批產(chǎn)品中特定微生物的數(shù)量。我們做的是什么測(cè)試?限制是一個(gè)破壞性的實(shí)驗(yàn)–我們不能對(duì)整批進(jìn)展100%檢驗(yàn)。如何經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)來(lái)證明整批產(chǎn)品的微生物數(shù)量？要求有一個(gè)取樣方案來(lái)涵蓋整個(gè)批號(hào)。有足夠的取樣量和檢驗(yàn)量無(wú)抑菌要素如何對(duì)批進(jìn)展取樣？樣品必需具有批代表性：最易污染的位置取樣：批開(kāi)場(chǎng)、終了及艱苦缺點(diǎn)和調(diào)整后延續(xù)性隨機(jī)性上述取樣過(guò)程要有文件規(guī)定和記錄3.1取樣及樣品處置_取樣方案取多少樣〔檢驗(yàn)數(shù)量〕?藥典規(guī)定檢定量是：10克或10毫升同時(shí)要思索檢驗(yàn)損耗和復(fù)試3.2取樣及樣品處置_取樣量目的溶解：防止讀數(shù)時(shí)的干擾勻質(zhì)：保證檢驗(yàn)量消除抑菌要素：提高檢驗(yàn)靈敏度3.3取樣及樣品處置_供試液的制備方法:10ml/g樣品，加無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨至100ml,1小時(shí)內(nèi)運(yùn)用3.3取樣及樣品處置_供試液的制備無(wú)抑菌性水溶性液體樣品：無(wú)需處置無(wú)抑菌性油性液體樣品：加聚山梨酯20、80;乳濁液〔<45℃,<30min〕無(wú)抑菌性非水溶性固體體樣品：碾磨懸濁,加聚山梨酯80助溶具抑菌活性的供試品：稀釋、中和、洗、沖要有一個(gè)完好的取樣方案涵蓋整個(gè)批消費(fèi)過(guò)程，并要思索到“最壞情況〞以提高檢出能夠性。檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量應(yīng)滿(mǎn)足藥典要求。樣品處置消除干擾、提高靈敏度3.4取樣及樣品處置_結(jié)論我們期望什么?在整批產(chǎn)品中特定微生物的數(shù)量。我們做的是什么測(cè)試?微生物限制檢查是經(jīng)過(guò)目檢計(jì)數(shù)微生物在培育基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)來(lái)判別結(jié)果。如何經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)來(lái)證明整批產(chǎn)品的微生物數(shù)量〔負(fù)載〕？能支持微生物生長(zhǎng)并無(wú)菌_培育基的靈敏度檢查。培育基的保管控制無(wú)抑制微生物生長(zhǎng)的要素存在_方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)4.微生物限制檢查用培育基細(xì)菌：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培育基，30-35℃，培育48小時(shí)。霉菌：玫瑰紅鈉瓊脂培育基，23-28℃，培育72小時(shí)。酵母：酵母浸出粉胨培育基，23-28℃，培育72小時(shí)4.1微生物限制檢查用培育基4.2微生物限制檢查用培育基_靈敏度檢查一切培育基必需無(wú)菌〔陰性對(duì)照〕配制后用閱歷證的方法滅菌經(jīng)過(guò)陰性對(duì)照每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)展控制用代表菌平皿法證明培育基靈敏度－回收率>70%。藥典無(wú)要求檢查頻率：每次滅菌批〔至少滅菌參數(shù)變卦后4.3微生物限制檢查用培育基_保管應(yīng)規(guī)定保管有效期:在密閉容器中一年，非密閉容器中一月2-25°保管確保pH在密閉容器中保管運(yùn)用三種微生物培育基有效控制微生物培育基的保管和效期4.4微生物限制檢查用培育基_結(jié)論5.微生物限制檢查方法藥典規(guī)定兩種方法:平皿法:加1ml樣品制備液至無(wú)菌平皿中，倒15-20ml,<45℃培育基混勻倒置培育。至少制備2個(gè)平板?？刂凭鋽?shù)在30-100CFU〔細(xì)菌〕，30-80CFU〔真菌〕薄膜過(guò)濾法：制備液用0.45m膜過(guò)濾并用3x100ml無(wú)菌蛋白胨水淋洗后，菌面朝上貼與培育基上。每種培育基制備一張膜控制菌落數(shù)<100CFU/膜假設(shè)樣品本身的混濁，會(huì)干擾計(jì)數(shù)結(jié)果要思索對(duì)樣品中抑菌要素進(jìn)展中和0.5％大豆磷脂4％聚山梨醇酯由于接種量限制，實(shí)驗(yàn)靈敏度受局限操作簡(jiǎn)便，設(shè)備要求低5.1微生物限制檢查方法_平皿法操作復(fù)雜，設(shè)備要求高不適用于無(wú)法溶解的樣品大體積檢驗(yàn)量，檢驗(yàn)靈敏度不受局限樣品中的抑菌要素可被濾除中和試劑可運(yùn)用在淋洗液中，如：?-內(nèi)酰胺酶分散劑可作為溶劑，如十四烷酸異丙酯5.2微生物限制檢查方法_薄膜過(guò)濾法兩種方法的共同點(diǎn):-培育基和培育溫度-培育時(shí)間-任務(wù)環(huán)境：100級(jí)區(qū)域進(jìn)展〔普通是要求與消費(fèi)的干凈條件一致〕5.3微生物限制檢查方法TSB培育基中增菌培育2天金葡菌：劃線(xiàn)甘露醇氯化鈉瓊脂30－35℃，培育1天。革蘭氏染色顯微察看。－無(wú)陽(yáng)性球菌大腸、沙門(mén)和綠膿：劃線(xiàn)麥康凱瓊脂30－35℃，培育1天，革蘭氏染色顯微察看。－無(wú)陰性桿菌控制菌檢查:5.4微生物限制檢查方法方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)_證明在實(shí)驗(yàn)條件下沒(méi)有抑菌作用，如：防腐劑，抗生素，中和劑，外表活性劑，…以下情況應(yīng)進(jìn)展重新驗(yàn)證：檢驗(yàn)方法變卦培育基變卦〔包括，滅菌參數(shù)變卦〕產(chǎn)品處方變卦菌種：大腸、金葡、枯草、白念、黑曲霉、控制菌5.5微生物限制檢查方法_方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)_證明在實(shí)驗(yàn)條件下沒(méi)有抑菌作用，如：防腐劑，抗生素，中和劑，外表活性劑，…以下情況應(yīng)進(jìn)展重新驗(yàn)證：檢驗(yàn)方法變卦培育基變卦〔包括，滅菌參數(shù)變卦〕產(chǎn)品處方變卦挑戰(zhàn)菌液：大腸、金葡、枯草，稀釋至50-100cfu/ml待用白念、黑曲霉，稀釋至30-80cfu/ml待用5.5微生物限制檢查方法_方法驗(yàn)證驗(yàn)證方法：實(shí)驗(yàn)組：挑戰(zhàn)菌液＋樣品制備后進(jìn)展實(shí)驗(yàn)供試品對(duì)照組：樣品制備后進(jìn)展實(shí)驗(yàn)菌液組：挑戰(zhàn)菌液進(jìn)展實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組：直接用稀釋液進(jìn)展實(shí)驗(yàn)5.5微生物限制檢查方法_方法驗(yàn)證驗(yàn)證合格規(guī)范細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)菌液組無(wú)雜菌生長(zhǎng)〔實(shí)驗(yàn)組－供試品對(duì)照組〕÷菌液組70％控制菌檢查實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)菌液組無(wú)雜菌生長(zhǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)組的菌落鑒定，確認(rèn)是所接種挑戰(zhàn)菌株5.5微生物限制檢查方法_方法驗(yàn)證報(bào)告：〔平均計(jì)數(shù)×稀釋倍數(shù)〕假設(shè)在1:10稀釋樣品中沒(méi)有檢出，報(bào)告<10cfu/g(ml)假設(shè)平均值有小數(shù)，應(yīng)取整數(shù)后乘稀釋倍數(shù)，例如：1:10稀釋樣品：平板1:1cfu;平板2：0cfu;平均為0.5報(bào)告結(jié)果是10cfu/ml,而不是5cfu/ml5.6微生物限制檢查方法_結(jié)果判別結(jié)論:有三種檢驗(yàn)方法，但所用培育基、培育溫度、時(shí)間一樣檢驗(yàn)方法應(yīng)驗(yàn)證證明，在實(shí)驗(yàn)條件下沒(méi)有抑菌效應(yīng)5.7微生物限制檢查方法_結(jié)論培育基:細(xì)菌:大豆胰蛋白瓊脂，30-35℃，培育48小時(shí)霉菌酵母：沙氏葡萄糖，20-25℃，培育5天6.微生物限制檢查_(kāi)USP引見(jiàn)美國(guó)藥典：多管法6.微生物限制檢查_(kāi)USP引見(jiàn)稀釋度管1管2管3空白1ml制備稀釋液＋9ml培養(yǎng)基1ml制備稀釋液＋9ml培養(yǎng)基1ml制備稀釋液＋9ml培養(yǎng)基1：101ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基1ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基1ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基A:1ml制備樣品＋9ml培養(yǎng)基1：1001mlA＋9ml培養(yǎng)基1mlA＋9ml培養(yǎng)基1mlA＋9ml培養(yǎng)基B：1mlA＋9ml培養(yǎng)基1：10001mlB＋9ml培養(yǎng)基1mlB＋9ml培養(yǎng)基1mlB＋9ml培養(yǎng)基中國(guó)藥典中對(duì)控制菌檢查有類(lèi)似方法要思索對(duì)樣品中抑菌要素進(jìn)展中和0.5％大豆磷脂4％聚山梨醇酯由于接種量限制，實(shí)驗(yàn)靈敏度受局限操作復(fù)雜，設(shè)備要求高適用于無(wú)法溶解的樣品6.微生物限制檢查_(kāi)USP引見(jiàn)美國(guó)藥典