生物化學儀器分析紫外

第3章紫外光譜—UltravioletSpectrometry,UV主講：孫立權2024/1/4104一月20242§3.1紫外吸收光譜分析根本原理PrinciplesofUV3.1.1紫外吸收光譜的產(chǎn)生3.1.2有機物紫外吸收光譜3.1.3有機物紫外吸收光譜3.1.4蛋白紫外吸收光譜3.1.5核酸紫外吸收光譜3.1.6紫外吸收光譜影響要素3.1.7顯色反響04一月20243§3.1紫外吸收光譜分析根本原理PrinciplesofUV3.1.1紫外吸收光譜的產(chǎn)生FormationofUV1.概述基于物質對紫外光選擇性吸收的分析方法。250300350400nm1234eλ04一月202442.物質對光的選擇性吸收及吸收曲線M+熱M+熒光或磷光E=E2-E1=h量子化；選擇性吸收定性根據(jù)。M+h→M*基態(tài)激發(fā)態(tài)E1〔△E〕E204一月20245可見—紫外波長范圍：100-800nm.(1)遠紫外光區(qū):100-200nm(2)近紫外光區(qū):200-400nm(3)可見光區(qū):400-800nm3.1.1紫外吸收光譜的產(chǎn)生

FormationofUV04一月20246可見光譜與紫外光譜的共同之處光譜法：可用于構造鑒定、定性和定量分析；定性根據(jù)：特征吸收；定量根據(jù)：朗伯—比耳定律；能級躍遷：分子中價電子能級躍遷；光譜外形：電子躍遷的同時，伴隨著振動、轉動能級的躍遷帶狀光譜。3.1.1紫外吸收光譜的產(chǎn)生

FormationofUV04一月20247可見光譜與紫外光譜的共同之處吸收曲線〔A-λ曲線〕吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要根據(jù)。關于吸收曲線的討論與可見光譜一樣3.1.1紫外吸收光譜的產(chǎn)生

FormationofUV04一月202483.電子躍遷與分子吸收光譜物質分子內部三種運動方式：〔1〕電子相對于原子核的運動；〔2〕原子核在其平衡位置附近的相對振動；〔3〕分子本身繞其重心的轉動。3.1.1紫外吸收光譜的產(chǎn)生

FormationofUV04一月20249分子具有三種不同能級：電子能級、振動能級和轉動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應的能量。分子的內能：電子能量Ee、振動能量Ev、轉動能量Er即Ｅ＝Ｅe+Ｅv+ＥrΔΕe>ΔΕv>ΔΕr3.電子躍遷與分子吸收光譜04一月202410能級躍遷電子能級間躍遷的同時，總伴隨有振動和轉動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉動能級間躍遷產(chǎn)生的假設干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。3.電子躍遷與分子吸收光譜04一月202411討論轉動能級間的能量差ΔΕr：0.005～0.050eV，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠紅外區(qū)。遠紅外光譜或分子轉動光譜；振動能級的能量差ΔΕv約為：0.05～１eV，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；電子能級的能量差ΔΕe較大1～20eV。電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在紫外—可見光區(qū)，紫外—可見光譜或分子的電子光譜。04一月202412討論吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決議，反映了分子內部能級分布情況，是物質定性的根據(jù)。吸收譜帶的強度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有關，也提供分子構造的信息。通常將在最大吸收波優(yōu)點測得的摩爾吸光系數(shù)εmax也作為定性的根據(jù)。不同物質的λmax有時能夠一樣，但εmax不一定一樣；吸收譜帶強度與該物質分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的根據(jù)。04一月2024131．有機化合物電子類型及電子躍遷類型三種價電子：σ電子、π電子、n/p電子；電子躍遷類型：n→π＊；π→π＊；n→σ＊；σ→σ＊。sp*s*RKE,BnpECOHnpsH3.1.2有機物紫外吸收光譜Ultravioletspectrometryoforganiccompounds04一月202414分子軌道實際：成鍵軌道—反鍵軌道。當外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷，所需能量ΔΕ大小順序為：n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊§3.1.2有機物紫外吸收光譜Ultravioletspectrometryoforganiccompounds04一月2024152σ→σ＊躍遷所需能量最大；σ電子只需吸收遠紫外光的能量才干發(fā)生躍遷；飽和烷烴的分子吸收光譜出如今遠紫外區(qū)；吸收波長λ<200nm；例：甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為nm。只能被真空紫外分光光度計檢測到；作為溶劑運用。04一月2024163n→σ＊躍遷所需能量較大。吸收波長為150～250nm，大部分在遠紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易察看到。末端吸收。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ＊躍遷。04一月2024174π→π＊躍遷所需能量較小，吸收波優(yōu)點于遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)，εmax普通在104L·mol－1·cm－1以上，屬于強吸收?！?〕不飽和烴π→π*躍遷乙烯π→π*躍遷的λmax為165nm,εmax為:1×104L·mol-1·cm-1。K帶——共軛非封鎖體系的π→π*躍遷C=C發(fā)色基團，但→*200nm。max=165nm助色基團取代*(K帶)發(fā)生紅移04一月202418165nm217nm

???

(HOMOLVMO)max〔2〕共軛烯烴中的→*5n→π＊躍遷含雜原子的雙鍵化合物，或者當有雜原子上的孤對電子與碳原子上的π*軌道，那么可產(chǎn)生n→π*躍遷吸收。200400nm。禁阻躍遷，吸收強度很弱，ε<102L·mol-1·cm-1。同時存在π→π*躍遷。丙酮π→π*躍遷〔K帶〕：λmax=194nm，εmax=9×103L·mol-1·cm-1；丙酮n→π*躍遷〔R帶〕：λmax=280nm，εmax=22L·mol-1·cm-1(溶劑環(huán)己烷)。04一月202420飽合有機化合物的電子躍遷類型為σ→σ*，n→σ*躍遷，吸收峰普通出如今真空紫外區(qū)，吸收峰低于200nm，實踐運用價值不大。

不飽合機化合物的電子躍遷類型為n→π*，π→π*躍遷，吸收峰普通大于200nm。

6.生色團與助色團最有用的紫外光譜是由π→π*和n→π*躍遷產(chǎn)生。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。生色團：是指分子中可以吸收光子而產(chǎn)生電子躍遷的原子基團。能產(chǎn)生紫外--可見吸收、含有π鍵的不飽和基團稱。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基C=C、羰基C=O、亞硝基N=O、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C三N等?！瞔hromophore〕04一月2024226.生色團與助色團助色團：一些含有n電子的基團(如--OH、--OR、--NH２、--NHR、--X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當它們與生色團相連時，就會發(fā)生n—π共軛作用，加強生色團的生色才干(吸收波長向長波方向挪動，且吸收強度添加)，這樣的基團稱為助色團。(auxochrome)04一月2024237.紅移與藍移紅移:λmax向長波方向挪動。藍移(或紫移):λmax向短波方向挪動。增色效應或減色效應:吸收強度即摩爾吸光系數(shù)ε增大或減小的景象分別稱為~~。有機化合物的吸收譜帶經(jīng)常因引入取代基或改動溶劑使最大吸收波長λmax和吸收強度發(fā)生變化。04一月2024249.有機化合物的吸收帶吸收帶(absorptionband):在紫外光譜中，吸收峰在光譜中的波帶位置。根據(jù)電子及分子軌道的種類，可將吸收帶分為四種類型。R吸收帶K吸收帶B吸收帶E吸收帶吸收帶及吸收帶類型吸收峰對應的波長位置稱為吸收帶。R吸收帶：由于發(fā)生n→π＊躍遷而產(chǎn)生的吸收帶。n→π＊為禁阻躍遷，躍遷幾率很小；普通地，R吸收帶的270nm，100；當運用極性溶劑時，R吸收帶發(fā)生藍移。04一月202426吸收帶及吸收帶類型K吸收帶：由π→π*躍遷而產(chǎn)生的吸收帶。發(fā)生在共軛烯炔分子；吸收很強，ε>104；波長位置小于R吸收帶。1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮非極性→極性n→*躍遷：蘭移；；→*躍遷：紅移；；04一月202427吸收帶及吸收帶類型B吸收帶：位于278nm的吸收帶。由苯環(huán)的π→π*躍遷引起；吸收較強，ε=1100；在非極性溶劑中測定時有精細構造，而在極性溶劑中精細構造消逝。當芳環(huán)與發(fā)色團直接相連時會同時出現(xiàn)K、B兩帶(B帶波長較長)，且B帶產(chǎn)生紅移。假設分子中含有n電子，還會有R帶同時出現(xiàn)。04一月202428吸收帶及吸收帶類型E吸收帶：在一定意義上，苯環(huán)可看成三個共軛的乙烯組成。苯環(huán)中的這種乙烯鍵和共軛乙烯鍵引起的紫外吸收帶分別稱為E1和E2帶。四種吸收帶按能量高低陳列：普通有E1＞E2≥K＞B＞R04一月20242910.吸收波長的計算非共軛體系：飽和烷烴；有助色團取代的衍生物；孤立發(fā)色團。共軛體系：共軛烯烴。04一月202430165nm217nm

???

(HOMOLVMO)max基-----是由非環(huán)或六環(huán)共軛二烯母體決議的基準值；無環(huán)、非稠環(huán)二烯母體：max=217nm共軛烯烴〔不多于四個雙鍵〕*躍遷吸收峰位置可由伍德沃德——菲澤規(guī)那么估算。max=基+niia.共軛烯烴中的→*異環(huán)〔稠環(huán)〕二烯母體：max=217nm同環(huán)〔非稠環(huán)或稠環(huán)〕二烯母體：max=253nmniI:由雙鍵上取代基種類和個數(shù)決議的校正項(1)每添加一個共軛雙鍵+30(2)環(huán)外雙鍵+5(3)雙鍵上取代基：?；?OCOR〕0鹵素〔-Cl，-Br〕+5烷基〔-R〕+5烷氧基〔-OR〕+621722704一月20243304一月202434b.羰基化合物共軛烯烴中的→*①Y=H,Rn→*180-190nm→*150-160nmn→*275-295nm②Y=-NH2,-OH,-OR等助色基團K帶紅移，R帶蘭移；R帶max=205nm；10-100KKRR

n

n165nm

n③不飽和醛酮K帶紅移：165250nmR帶紅移：290310nm04一月202435c.,-不飽和羧酸及其酯→*躍遷K帶紅移程度小于,-不飽和酮,max約200240nm，104。由于存在這種共軛，羰基的親電子性降低，即接受C=C上電子，構成→*躍遷的才干降低，使,-不飽和酸及酯發(fā)生→*躍遷需求較大的能量，max藍移。04一月202436d.芳香烴及其雜環(huán)化合物苯：E1帶180184nm；=47000E2帶200204nm=7000苯環(huán)上三個共軛雙鍵的→*躍遷特征吸收帶；B帶230-270nm=200→*與苯環(huán)振動引起；含取代基時，B帶簡化，紅移。

max〔nm〕max苯254200甲苯261300間二甲苯2633001，3，5-三甲苯266305六甲苯27230004一月202437乙酰苯紫外光譜圖羰基雙鍵與苯環(huán)共軛：K帶強；苯的E2帶與K帶合并，紅移；取代基使B帶簡化；氧上的孤對電子：R帶，躍遷禁阻，弱；CCH3On→*;R帶→*;K帶04一月202438苯環(huán)上助色基團對吸收帶的影響04一月202439苯環(huán)上發(fā)色基團對吸收帶的影響04一月202440.立體構造和互變構造的影響順反異構：順式：λmax=280nm；εmax=10500反式：λmax=295.5nm；εmax=29000互變異構：酮式：λmax=204nm烯醇式：λmax=243nm立體構造和互變構造的影響04一月202442.溶劑的影響1：乙醚2：水12250300苯酰丙酮非極性→極性n→*躍遷：蘭移；；→*躍遷：紅移；；極性溶劑使精細構造消逝.溶劑的影響非極性極性n

npn<p

np

非極性極性n>pn→*躍遷：蘭移；；→*躍遷：紅移；；

max(正己烷)max(氯仿)max(甲醇)max(水)

230238237243n329315309305§3.1.3無機化合物紫外可見吸收光譜

1.電荷遷移躍遷(1)配合物的電荷遷移躍遷配合物分子吸收光輻射后，分子中的電子由配體的軌道躍遷到與中心離子相關的軌道上，或按相反方向轉移，產(chǎn)生電荷遷移躍遷吸收光譜。這種電荷遷移光譜通常發(fā)生在具有d電子的過渡金屬離子和有丌鍵的共軛體系的有機配位化合物及許多水合無機離子中。這種配合物電荷遷移躍遷可表達為：無機配位化合物紫外----可見吸收光譜的電子躍遷方式主要有電荷遷移躍遷和配位場躍遷兩種方式。Mn+—Lb-M(n-1)+—L(b-1)-h04一月202445(2)過渡金屬離子與生色團試劑生成配合物的電荷遷移躍遷如Fe(Ⅲ)與CNS離子配位。[Fe3+CNS-]2+h[Fe2+CNS]2+電子給予體電子接受體分子內氧化復原反響；>104Fe2+與鄰菲羅啉配合物的紫外吸收光譜屬于此。2024/1/4電荷遷移吸收光譜的波長取決于電子給予體和電子接受體相應軌道的能量差。如金屬離子的氧化性強，而配位體L的復原性強，那么發(fā)生電荷遷移所需的能量較小，那么吸收光波長會發(fā)生紅移

電荷遷移躍遷吸收光譜的譜帶較寬，并易受環(huán)境要素的影響，用其波譜定性及構造分析比較困難。但電荷遷移吸收光譜最大的特點是摩爾吸收系數(shù)很大，普通在104～107。因此，用這類吸收譜帶進展定量分析時，可以顯著提高檢測的靈敏度。相反，那么吸收光波長會發(fā)生紫移。2.配位場躍遷〔1〕配體微擾的金屬離子d-d電子躍遷和f-f電子躍遷在配體的作用下過渡金屬離子的d軌道和鑭系、錒系的f軌道裂分，吸收輻射后，產(chǎn)生d一d、f一f躍遷；必需在配體的配位場作用下才能夠產(chǎn)生也稱配位場躍遷；

〔2〕金屬離子微擾的配位體內電子躍遷金屬離子的微擾，將引起配位體吸收波長和強度的變化。變化與成鍵性質有關，假設共價鍵和配位鍵結合，那么變化非常明顯。摩爾吸收系數(shù)ε很小，對定量分析意義不大，但可用于研討配合物的構造，為現(xiàn)代無機配合物鍵合實際的建立、金屬酶和生物無機化學等提供非常有用的信息。2024/1/4§3.1.4蛋白質紫外吸收光譜

蛋白質具有很強的紫外吸收，通常情況下普通蛋白質在紫外區(qū)的最大峰在280nm左右(見圖2．8)。04一月202449§3.1.4蛋白質紫外吸收光譜

利用蛋白質的這一特性，可以設計多種蛋白質定量分析的方法。同時，蛋白質的最大吸收峰不同于核酸的260nm最大吸收峰。基于這種差別，依然可以利用紫外吸收對含有DNA的蛋白質樣品進展定量分析。在小于240nm波長的紫外區(qū)有很強的光吸收效應，但較難利用這一特性。這是由于，在這一紫外區(qū)，很多緩沖液具有很強的紫外吸收，并且緩沖液普通濃度很高，這會嚴重干擾蛋白質的定量分析。但假設背景緩沖液不具有紫外吸收的特性，那么可以充分利用蛋白質在200～220nm的強紫外吸收性質。04一月202450§3.1.4蛋白質紫外吸收光譜

蛋白質的紫外吸收特性主要是由蛋白質所含的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等引起。由于苯環(huán)(包括共軛雙鍵等)的存在，這幾種氨基酸在240～300nm的紫外區(qū)內均具有強力的光吸收特性；雖然其他氨基酸也具有紫外吸收的性質，但在此紫外區(qū)內普通很弱，對蛋白質的紫外吸收奉獻不大。04一月202451§3.1.4蛋白質紫外吸收光譜

蛋白質的紫外吸收受多種要素的影響。由于蛋白質分子為高分子聚合物，其構象受多種要素(如溶液的pH、離子強度、金屬離子、溫度和變性劑等)的影響；而蛋白質構象的變化會改動具有紫外吸收的氨基酸在蛋白質外表的分布，進而影響蛋白質的紫外吸收光譜。特別值得留意的是，如蛋白質富含紫外吸收的氨基酸，其吸收系數(shù)會添加；相反，那么降低。這在蛋白質的定量分析時需求留意。04一月202452§3.1.5核酸紫外吸收光譜

核苷、核苷酸、核酸的成分都有嘌呤和嘧啶堿基，這些堿基全含有共軛雙鍵，使得這些堿基能劇烈吸收240～290nm波段的紫外線，最大吸收在260nm左右。因此核酸、核苷酸和核苷具有紫外吸收特性，DNA鈉鹽在230nm處為吸收低谷，但它的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光度(absorbance)以A260表示，A260是核酸的重要性質，在核酸的研討中很有用途。RNA鈉鹽的吸收曲線與DNA的無明顯區(qū)別。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以用紫外分光光度計加以定量及定性測定。04一月202453§3.1.5核酸紫外吸收光譜

雙鏈DNA和單鏈DNA的紫外光譜類似，摩爾吸收系數(shù)有大差。緣由：雙鏈中堿基被包裹在雙鏈內部，弱；單鏈外露，強。04一月202454溫度對DNA的紫外吸收有明顯的影響。在溫度為70°C以下，DNA以雙鏈方式存在，因此紫外吸收相對較低。在70～85°C時，溫度對DNA的紫外吸收具有顯著的影響。85°C以后，溫度的添加對DNA紫外吸收的影響很弱，這是由于在85°C以上，DNA以單鏈方式存在，紫外吸收接近最大值。變性溫度(meltingtemperature，Tm)是指雙鏈DNA分別成兩個單鏈DNA時對應的溫度。這一特性對DNA的分別分析非常重要。如PCR的設計就是基于DNA的變性溫度的根底?！?.1.6影響UV－Vis分析的要素：【1】溫度

【3】溶液的濃度【2】pH的影響【4】光源狹縫的寬度【5】背景的吸收

1】條件化學反響，也就是顯色反響對多種物質進展測定，常利用顯色反響將被測組分轉變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸收的物質。常見的顯色反響有配位反響、氧化復原反響等?！?.1.7顯色反響〔條件和影響要素〕這些顯色反響，必需滿足以下條件：

【4】.反響生成物的組成恒定?！?】.反響生成的產(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性，以保證丈量過程中溶液的吸光度不變；【2】．反響有較高的選擇性，即被測組分生成的化合物吸收曲線應與共存物質的吸收光譜有明顯的差別；【1】．反響的生成物必需在紫外-可見光區(qū)有較強的吸光才干，即摩爾吸光系數(shù)較大；影響顯色反響的要素：【1】．酸度顯色反響最適宜的酸度范圍可經(jīng)過實驗來確定：測定某一固定濃度的試樣的吸光度隨酸度的變化，以吸光度為縱坐標，溶液的PH值為橫坐標作圖?！?】.顯色時間和溫度【2】.顯色劑的用量

測定試樣溶液的吸光度，需先用參比溶液調理透光度〔吸光度為0〕為100%，以消除其它成分及吸光池和溶劑等對光的反射和吸收帶來的測定誤差?！?〕、參比溶液的選擇參比溶液的選擇視分析體系而定，詳細有：1】．溶劑參比試樣簡單、共存其它成分對測定波長吸收弱，只思索消除溶劑與吸收池等要素；

2】．試樣參比假設試樣基體溶液在測定波長有吸收，而顯色劑不與試樣基體顯色時，可按與顯色反響一樣的條件處置試樣，只是不參與顯色劑。3】．試劑參比假設顯色劑或其它試劑在測定波長有吸收，按顯色反響一樣的條件，不參與試樣，同樣參與試劑和溶劑作為參比溶液。

4】.平行操作參比用不含被測組分的試樣，在一樣的條件下與被測試樣同時進展處置，由此得到平行操作參比溶液。§3.2紫外分光光度計

Ultravioletspectrometer一、根本組成generalprocess二、分光光度計的類型typesofspectrometer04一月202463一、根本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射延續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的運用壽命?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的延續(xù)光譜。04一月2024642、單色器將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出任一波長單色光的光學系統(tǒng)。棱鏡資料——石英04一月2024653、樣品室樣品室放置各種類型的吸收池〔比色皿〕和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)普通用玻璃池。04一月2024664、檢測器利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號常用的有光電池、光電管或光電倍增管。04一月2024675、結果顯示記錄系統(tǒng)檢流計、數(shù)字顯示、微機進展儀器自動控制和結果處置。04一月202468二、紫外分光光度計的類型1.單光束：簡單，價廉，適于在給定波優(yōu)點丈量吸光度或透光度，普通不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束：自動記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等要素的影響，特別適宜于構造分析。儀器復雜，價錢較高。04一月202469二、分光光度計的類型3.雙波長：將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快速交替經(jīng)過同一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。△=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數(shù)光譜。04一月202470光路圖04一月202471§3.3紫外吸收光譜的運用ApplicationsofUV一、定性和定量分析qualitativeandquantitativeanalysis二、有機物構造確定structuredeterminationoforganiccompounds04一月202472一、定性、定量分析1.定性分析max：化合物特性參數(shù)，可作為定性根據(jù)；有機化合物紫外吸收光譜：反映構造中生色團和助色團的特性，不完全反映分子特性；計算吸收峰波長，確定共軛體系等甲苯與乙苯：譜圖根本一樣；構造確定的輔助工具；max，max都一樣，能夠是一個化合物；規(guī)范譜圖庫：46000種化合物紫外光譜的規(guī)范譜圖?Thesadtlerstandardspectra,Ultraviolet?04一月20247304一月2024742.純度鑒定根據(jù)：max；峰外形和數(shù)量；A。生物大分子紫外吸收特征。核酸分子中含有堿基，max=260nm核酸典型吸收：260nm；純核酸A280/A260=0.5。蛋白質分子中含有芳香族氨基酸，max=280nm蛋白質典型吸收：280nm；純蛋白A280/A2601.8。3.定量分析根據(jù)：朗伯-比耳定律吸光度：A=bc；透光度：-lgT=bc。靈敏度高：max：104～105L·mol-1·cm-1；丈量誤差與吸光度讀數(shù)有關：A=0.434，讀數(shù)相對誤差最?。?4一月202475代入朗伯-比爾定律有：Δc/c=0.4343ΔT/TlgT要使測定的相對誤差Δc/c最小，求導取極小得出：lgT=-0.4343=A即當A=0.4343時，吸光度丈量誤差最小。最適宜的丈量范圍為0.2~0.8之間。測定方法

【1】單組分定量方法單組分是指樣品溶液中含有一種組分，或者是在混合物溶液中待測組分的吸收峰與其他共有物質的吸收峰無重疊。其定量方法包括校準曲線法、規(guī)范對比法和吸收系數(shù)法。1校準曲線法方法：配制一系列不同含量的規(guī)范溶液，選用適宜的參比，在一樣的條件下，測定系列規(guī)范溶液的吸光度，作A-c曲線，即規(guī)范曲線，也可用最小二乘數(shù)處置，得線性回歸方程。在一樣條件下測定未知試樣的吸光度，從規(guī)范曲線上就可以找到與之對應的未知試樣的濃度。【2】規(guī)范對比法即將待測溶液與某一標樣溶液，在一樣的條件下，測定各自的吸光度，建立朗伯-比爾定律，解方程求出未知樣濃度與含量。

As=KcsAx=Kcx【3】F因子法

二、有機化合物構造輔助解析

1.由紫外譜圖可獲得的構造信息〔1〕200-400nm無吸收峰。飽和化合物，單烯，非共軛烯。〔2〕270-350nm有吸收峰〔ε=10-100〕醛酮n→π*躍遷產(chǎn)生的R帶。〔3〕250-300nm有中等強度的吸收峰〔ε=200-2000〕，芳環(huán)的特征吸收〔具有精細解構的B帶〕。〔4〕200-250nm有強吸收峰〔ε104〕，闡明含有一個共軛體系〔K〕帶。共軛二烯：K帶〔230nm〕；不飽和醛酮：K帶230nm，R帶310-330nm260nm,300nm,330nm有強吸收峰，3,4,5個雙鍵的共軛體系。04一月2024802.光譜解析本卷須知(1)確認max，并算出㏒ε，初步估計屬于何種吸收帶；(2)察看主要吸收帶的范圍，判別屬于何種共軛體系；(3)乙?；灰艬帶：262nm(ε302)274nm(ε2040)261nm(ε300)(4)pH值的影響加NaOH紅移→酚類化合物，烯醇。加HCl蘭移→苯胺類化合物。04一月2024813.分子不飽和度的計算定義：不飽和度是指分子構造中到達飽和所缺一價元素的“對〞數(shù)。如：乙烯變成飽和烷烴需兩個氫原子，不飽和度為1。計算：假設分子中僅含一，二，三，四價元素(H，O，N，C)，那么可按下式進展不飽和度的計算：