細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)性疾病

第二講

細(xì)胞凋亡與凋亡相關(guān)性疾病(Apoptosisandapotosisassociateddiseases)有絲分裂細(xì)胞增多動態(tài)平衡細(xì)胞凋亡細(xì)胞減少新生細(xì)胞出現(xiàn)，產(chǎn)生相應(yīng)功能機(jī)體正常生原有的、不必要的、有害的細(xì)胞除去長發(fā)育細(xì)胞凋亡的研究發(fā)展階段：1.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)研究階段（1972-1987）:1）利用光鏡和電鏡對形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)的研究。2）染色體DNA的降解：細(xì)胞凋亡的一個顯著特征就是細(xì)胞染色質(zhì)的DNA降解。3）RNA/蛋白質(zhì)大分子的合成。4）鈣離子變化，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個重要條件。5）內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活性增高：細(xì)胞發(fā)生凋亡是需要這種核酸內(nèi)切酶參與的。2.細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)研究階段:

1）與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因及調(diào)控

2）細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

3）與細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子及其相互作用

4)細(xì)胞凋亡的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究細(xì)胞凋亡的研究，其生命力（最終目的）在于：闡明疾病發(fā)生的機(jī)制，以及探索新的疾病治療方法。

細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖、分化和死亡是細(xì)胞的4大特點(diǎn)。細(xì)胞死亡分為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動的死亡過程，在基因嚴(yán)格調(diào)控下的細(xì)胞“自殺”行為，也稱為細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）,與細(xì)胞壞死不同。第一節(jié)概述一、細(xì)胞凋亡概念和特征

細(xì)胞壞死（necrosis）是在各種致病因素（如缺氧、物理、化學(xué)和生物學(xué)因素）的劇烈刺激下的病理性死亡。其特點(diǎn)是:

引起死亡的因素劇烈，死亡迅速。能量代謝下降—膜通透性增加—細(xì)胞水腫—細(xì)胞器破裂，細(xì)胞溶解，DNA不斷裂—內(nèi)含物釋放—引起炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡(Apoptosis):細(xì)胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,結(jié)束其生命的生理性死亡，是受基因嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞自殺現(xiàn)象。凋亡過程中，細(xì)胞骨架蛋白分解—細(xì)胞和細(xì)胞器濃縮而不裂解—染色體DNA斷裂和形成凋亡小體—細(xì)胞內(nèi)含物不外泄，不引起炎癥反應(yīng)。最后凋亡小體被巨噬細(xì)胞識別和吞噬。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞：首先變圓，體積縮小，與鄰近細(xì)胞的連接喪失，失去微絨毛，胞漿濃縮。細(xì)胞核的變化：胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮形成密集顆粒呈帽狀(或新月形)，位于核被膜下。核被膜下核纖層分解，隨后細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮為不均一點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜：相鄰細(xì)胞間連接復(fù)合體普遍消失，其他細(xì)胞膜特有結(jié)構(gòu)如微絨毛等亦隨之消失。此時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)仍保持完整。細(xì)胞器：線粒體：保持完整呈正常狀態(tài)溶酶體：保持完整，內(nèi)容物不外泄形成凋亡小體：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及核被膜膨大,形成泡狀結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜融合，以出泡方式離開正在死亡的細(xì)胞，將所包含的完整細(xì)胞器和核碎片等細(xì)胞內(nèi)容物以細(xì)胞質(zhì)膜包被成凋亡小體(apoptosisbodies）釋放到細(xì)胞外。凋亡小體很快被周圍鄰近間質(zhì)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬，而不引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡Apoptosis和細(xì)胞壞死NecrosisApoptoticCellandMacrophage細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征：

核酸內(nèi)切酶活化與DNA電泳呈梯子狀改變是Apoptosis的生物化學(xué)標(biāo)志。核酸內(nèi)切酶在核小體連接處將DNA鏈切斷，從而最終產(chǎn)生寡聚核小體。這些寡聚核小體的大小均是DNA長度為180-200個堿基對(bp)的倍數(shù)，因此用瓊脂糖凝膠電泳測定細(xì)胞DNA時出現(xiàn)特征性的“梯狀”（ladder）帶紋。10LadderPatternofApoptoticCells二、細(xì)胞凋亡的生理意義

1.維持組織器官的細(xì)胞類型和細(xì)胞總量的基本平衡，清除衰老損傷的細(xì)胞：皮膚、粘膜細(xì)胞的更新等。

2.在胚胎發(fā)育中起重要作用

a.手指和腳趾的形成等。b.大腦神經(jīng)元之間形成連接時多余的神經(jīng)細(xì)胞通過凋亡清除掉。c.在淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟中起重要作用。d.心臟發(fā)育過程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通過細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。

3.細(xì)胞凋亡異?？梢鹉[瘤和神經(jīng)退行性病變等疾病。一、半胱天冬酶（胱冬酶，caspase，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，cysteine-containingaspartate-specificprotease)第二節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)Activesite:CysteineCleavagesite:Asparaticacid

Cysteine

AsparaticacidspecificproteaseAsp-Xxx天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶Caspase的含義表現(xiàn)在兩個方面：1）它們?yōu)榘腚装彼岬鞍酌割?，并且把半胱氨酸作為對底物裂解時的親核基團(tuán)，2）它們?yōu)樘於彼岬鞍酌割悾懈钐於彼岬聂然c下一個氨基酸的氨基形成的肽鍵。

Asp特異性半胱氨酸蛋白酶是一類促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白水解酶，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，成為細(xì)胞凋亡的“中心處理器”，即各種細(xì)胞凋亡信號通過傳遞最終激活胱冬酶，胱冬酶通過水解不同的蛋白質(zhì)引起細(xì)胞凋亡。人體caspase基因是細(xì)胞凋亡的活化基因。1.Caspase的結(jié)構(gòu)和功能Caspase

共有十多種，結(jié)構(gòu)相似，都以酶原的形式分泌。酶原水解激活后產(chǎn)生前結(jié)構(gòu)域（N端結(jié)構(gòu)域）、大亞基和小亞基三部分，然后大小亞基聚合形成有活性的四聚體。N端結(jié)構(gòu)域——參與酶功能激活調(diào)節(jié);大、小亞基——提供與底物結(jié)合及催化所需的氨基酸。Caspase

可專一、高效地特異性水解一系列蛋白質(zhì)底物,并導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能喪失或改變。

caspase

酶原

前結(jié)構(gòu)域+大亞基

+小亞基

大異二聚體小

大大異四聚體活性形式

小小前結(jié)構(gòu)域大亞基小亞基Caspase

作用：

是一類蛋白水解酶，可特異水解底物蛋白分子中天冬氨酸羧基側(cè)的肽健，且對此Asp前面的4個氨基酸殘基有要求。從而激活該蛋白質(zhì)或改變蛋白質(zhì)的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。N·

·

·

·A-B-C-D-Asp-X·

·

·

·C

不同的Caspase對ABCD種類要求不同。

Caspase是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，引起細(xì)胞凋亡的各種因素，通過凋亡信息傳遞途經(jīng)最終激活caspase，caspase通過水解不同的蛋白質(zhì)改變細(xì)胞特性，引起細(xì)胞凋亡。其中caspase3的作用最重要。并非所有的凋亡過程都有caspase的參與。2.Caspase的分類（1）上游/啟動型caspase:2、8、9、10，12

處于細(xì)胞凋亡信號傳遞途徑的上游，在凋亡信號的刺激下首先被激活，然后再水解激活下游的caspase.（2）下游/執(zhí)行型caspase:3、6、7

處于細(xì)胞凋亡信號傳遞途徑的下游，被上游caspase激活后直接水解與細(xì)胞凋亡有關(guān)的底物蛋白，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變以及DNA的斷裂。3.Caspase的底物1、細(xì)胞骨架蛋白：核纖層蛋白、肌動蛋白、核分裂相關(guān)蛋白等十幾種蛋白。2、與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶，阻止DNA損傷的修復(fù)。如：

DNA依賴性蛋白激酶、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白。3、激活DNA酶，促進(jìn)DNA斷裂。二、死亡受體及相關(guān)蛋白

是一類參與外源性細(xì)胞凋亡途經(jīng)的蛋白質(zhì)：

*死亡配體（細(xì)胞外）→死亡受體（細(xì)胞膜）→相關(guān)蛋白（中介蛋白，細(xì)胞內(nèi)）→激活caspase→誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡1.死亡受體(deathreceptor,DR)死亡受體——是一類跨膜蛋白，與其配體結(jié)合后可把凋亡信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。主要的死亡受體是TNF-R超家族；配體死亡受體

TNF-αTNF-R1

FasL

Fas（CD95/APO-1）

APO-3LDR-3（WOL-1）

APO-2DR-4（TRAIL-R1）

TRAILDR-5（TRAIL-R2）Fas的分子結(jié)構(gòu)DD——deathdomainDED——deatheffectordomainFADD——FasassociateddeathdomainproteinDeathDomain-死亡結(jié)構(gòu)域Fas–associatedproteinwithdeathdomainproteinTNFreceptor-1–associateddeathdomainproteinApoptosis死亡受體相關(guān)蛋白

（中介蛋白/接頭蛋白）

是連接死亡受體和caspase的中介蛋白，把凋亡信號從死亡受體傳遞給caspase。(1)FADD（Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，F(xiàn)as

associateddeathdomainprotein)由兩部分構(gòu)成：

A:死亡結(jié)構(gòu)域：與Fas的DD相互作用

B:死亡效應(yīng)區(qū)：與啟動型caspase2、8、9、10作用介導(dǎo)Fas和TNFR-1兩種受體的細(xì)胞凋亡信號。

(2)TRADD（TNFR-1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）

從TNFR-1接受死亡信號，然后傳遞給FADD.也可以將死亡信號由死亡受體Fas傳遞到Caspase三、凋亡蛋白酶激活因子

（apoptosisproteaseactivationfactor,Apaf）參與細(xì)胞凋亡的線粒體信息傳遞途經(jīng)。細(xì)胞凋亡與線粒體膜電位及通透性改變有關(guān)。凡是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素，都可使線粒體的膜電位下降，膜通透性增加，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）開放，釋放出多種可激活caspase的蛋白因子，包括細(xì)胞色素c（Cytc

）和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)。

1細(xì)胞色素C（Cytc）細(xì)胞色素C是呼吸鏈的重要成員，是由線粒體DNA編碼的蛋白質(zhì)。細(xì)胞凋亡信號→線粒體膜通透性增加，CytC

釋放到胞漿→與Apaf-1和caspase-9結(jié)合形成復(fù)合體，誘導(dǎo)凋亡。

2凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptoticproteaseactivatingfactor-1,Apaf-1）

在正常情況下Apaf-1以無活性的單體存在于細(xì)胞質(zhì)，在凋亡信號的作用下，其N-端與Caspase-9結(jié)合，其C端與細(xì)胞色素C結(jié)合。形成Cytc-Apaf-1-Caspase-9

復(fù)合體（凋亡酶體，apoptosome)。首先激活caspase-9，然后激活下游的caspase3，6，7等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3凋亡誘導(dǎo)因子

（Apoptosisinducingfactor,AIF）凋亡誘導(dǎo)因子是一類存在于線粒體內(nèi)、外膜間隙的保守的黃素蛋白，具有雙重功能。在細(xì)胞正常的生理狀態(tài)下，AIF作為線粒體氧化還原酶，能催化細(xì)胞色素c（Cyt-c）和NAD之間的電子傳遞。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡的刺激時，線粒體膜通透性改變，AIF從線粒體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與線粒體蛋白質(zhì)endonucleaseG(EndoG)一起引起細(xì)胞染色體的凝聚和DNA大的片段化。四、bcl-2家族Bcl-2家族成員都含有1-4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4），并且通常有一個羧端跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembraneregion,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域，BH3是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將Bcl-2基因家族分為兩類，一類是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一類是促進(jìn)凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結(jié)構(gòu)，如Bid、Bad。Bcl-2蛋白主要定位于線粒體外膜，也存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上，主要功能是拮抗促凋亡蛋白。而大多數(shù)促凋亡蛋白則主要定位于細(xì)胞質(zhì)，一旦細(xì)胞受到凋亡因子的誘導(dǎo)，它們可以向線粒體轉(zhuǎn)位，通過寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道，從而導(dǎo)致線粒體中的凋亡因子釋放，激活caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。1.bcl-2和bcl-xl的作用1是最重要的細(xì)胞凋亡抑制基因，為膜結(jié)合蛋白2可以與bax

形成二聚體bcl-2/bcl-xl·bax

當(dāng)bax＞bcl-2/bcl-xl時，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡當(dāng)bax＜bcl-2/bcl-xl時，抑制細(xì)胞凋亡3降低線粒體膜通透性，抑制cytc、AIF等釋放。4抑制自由基的產(chǎn)生，抑制氧化劑對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。5許多抗癌藥物如紫杉醇可使bcl-2磷酸化而失活。從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。6HIV病毒蛋白水解酶可水解bcl-2,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。2.bax、bcl-xs、bad的作用1.屬于凋亡促進(jìn)基因。在凋亡信號作用下，p53表達(dá)升高，p53進(jìn)一步誘導(dǎo)Bax表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.Bax在線粒體外膜形成寡聚體，形成通道使線粒體膜的通透性增加，促進(jìn)CytC、Apaf-1等的釋放，激活caspase，促進(jìn)凋亡。3.當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax含量遠(yuǎn)大于bcl-2和bcl－xl時，Bax

自身形成的二聚體Bax·Bax，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。bcl-2

二聚體抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖bax

二聚體促進(jìn)凋亡p53促進(jìn)

bax

蛋白的合成BcL-2家族抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類蛋白的比例決定了細(xì)胞在受到凋亡信號刺激時是否發(fā)生凋亡第三節(jié)細(xì)胞凋亡通路目前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡有3條通路：

1.死亡受體通路

2.線粒體通路

3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路1.死亡受體通路（外源性凋亡途經(jīng)）

過程：配體（TNF/Fas)與死亡受體結(jié)合→與接頭蛋白（FADD/TRADD）結(jié)合→與caspase-8(caspase-10)結(jié)合聚集形成凋亡酶體（apoptosome)→caspase-8(caspase-10)自身切割激活→水解激活caspase-3→細(xì)胞凋亡。一、細(xì)胞凋亡的三條通路由存在于細(xì)胞膜上的死亡受體介導(dǎo)，將外源性凋亡信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡。常見的死亡受體包括：TNFR、Fas、DR3、DR4、DR5等。ProcessofCellApoptosisMediatedbyDeathReceptor死亡受體與配體結(jié)合，使受體三聚化受體胞內(nèi)DD區(qū)構(gòu)象改變，與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合FADD的N端DED區(qū)與caspase-8（或-10）前體蛋白結(jié)合，形成凋亡誘導(dǎo)的信號復(fù)合體（DISC）caspase-8、10自身剪切激活，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)caspase-3，-6，-7激活降解CAD抑制蛋白（ICAD/DFF-45），釋放出caspase依賴的DNase（CAD）降解DNA，引發(fā)細(xì)胞凋亡2.線粒體通路（內(nèi)源性凋亡途經(jīng)）過程：活性氧（氧自由基）/DNA損傷→Bax在線粒體膜上形成寡聚體通道(拮抗線粒體膜上bcl-2的作用）→線粒體內(nèi)的cytC

漏出線粒體→cytC+Apaf-1+caspase-9

+ATP→凋亡酶體（位于細(xì)胞液）→caspase－9自身切割激活→水解激活caspase-3→細(xì)胞凋亡e.g.

紫外線/X-射線等→DNA損傷→p53表達(dá)增加→通過以上過程誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡CellApoptosisMediatedbyMitochondria

物理或化學(xué)凋亡信號激活Bax、Bad、Bid等促凋亡蛋白，線粒體PT孔開放或形成線粒體凋亡因子（Cytc等）滲透出線粒體ProcessofCellApoptosisMediatedbyMitochondriaCytc與Apaf-1及pro-caspase-9組成凋亡體caspase-9激活降解ICAD及細(xì)胞功能或結(jié)構(gòu)蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡caspase-3激活線粒體-細(xì)胞凋亡3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、膜蛋白的合成、修飾和折疊等方面有關(guān)鍵性作用。Caspase-12

位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡所必須的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致Ca2+釋放進(jìn)入胞漿，激活Calpain（鈣激活的中性蛋白酶），水解并激活caspase-12，同時也導(dǎo)致caspase-7的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。過程：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)內(nèi)[Ca2+]→錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累→ER膜上Bax和Bak聚集→激活膜上的caspase-12（自我切割）→水解激活caspase-3→細(xì)胞凋亡

Caspase-independentCellApoptosis實驗證明，caspase的抑制不能阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生，表明細(xì)胞凋亡還以不依賴于caspase

的方式發(fā)生。不依賴caspase的細(xì)胞凋亡涉及到Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，也涉及到其他蛋白酶，如鈣蛋白酶、蛋白酶體及絲氨酸蛋白酶誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。二、細(xì)胞凋亡通路的調(diào)節(jié)

P53

是一種很重要的抑癌基因，其蛋白產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄因子，是一種很強(qiáng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子。誘導(dǎo)p21表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖。p53對死亡受體通路和線粒體通路均有調(diào)節(jié)作用。

p53Baxbcl-2→線粒體膜通透性增加→細(xì)胞凋亡（線粒體通路）

Fas表達(dá)增加，F(xiàn)as-FADD復(fù)合物增加→細(xì)胞凋亡（死亡受體通路）

2.bcl-2家族對線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路有調(diào)節(jié)作用。bcl-2家族在線粒體外膜形成寡聚體，使膜通透性降低→細(xì)胞色素C等不能釋放，抑制凋亡（線粒體通路）。聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，使膜通透性降低→內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子積累→抑制細(xì)胞凋亡（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路）。第四節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的疾病細(xì)胞的生長發(fā)育，分裂增殖，分化和死亡是細(xì)胞的基本生命活動，它們密切相關(guān)，正常情況下受到許多基因的嚴(yán)格調(diào)控，處于平衡狀態(tài)，一旦平衡失調(diào)，就會產(chǎn)生各種疾病，包括腫瘤。細(xì)胞凋亡的異常與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，如神經(jīng)細(xì)胞凋亡的增加可引起神經(jīng)退行性病變，心血管疾病也與心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。TheDiseasesAssociatedwithApoptosisRegulationAbnormalities細(xì)胞凋亡不足細(xì)胞凋亡過度腫瘤肝癌、惡性血液腫瘤、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌等發(fā)育異常氣管-食管瘺、房（室）間隙缺損、唇（腭）裂、短肢畸形、尿道下裂以及多囊腎等發(fā)育異常先天性消化道、膽道、肛門狹窄或閉鎖、動脈導(dǎo)管未閉、兩性畸形、甲狀舌骨囊腫等CNSAlzheimer病、Parkin-son病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、色素性視網(wǎng)膜病，脊肌肉萎縮、早老性癡呆免疫系統(tǒng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、橋本甲狀腺炎、多發(fā)性的硬化癥等免疫系統(tǒng)免疫缺陷病、AIDS一、細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起負(fù)調(diào)控作用。促凋亡基因被抑制抗凋亡基因被激活

細(xì)胞不能凋亡而存活期延長癌基因激活抑癌基因突變失活

細(xì)胞過度增殖和癌變

腫瘤相關(guān)病毒與細(xì)胞凋亡1.人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV)與人子宮頸癌（cervicalcancer)。其E6和E7蛋白可與強(qiáng)凋亡誘導(dǎo)蛋白p53結(jié)合而抑制其活性，從而對抗細(xì)胞凋亡和引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2.EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV)與伯基特淋巴瘤（Burkittslymphoma，BL）

A.產(chǎn)生一種與bcl-2類似的蛋白質(zhì)

B.病毒產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)可使bcl-2高表達(dá)以上兩種原因使細(xì)胞對抗凋亡和過度增生Bcl-2與腫瘤

1.bcl-2基因的過表達(dá)可導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生

通過染色體易位使bcl-2基因過表達(dá)。

最近發(fā)現(xiàn)bcl-2過表達(dá)還可引起其他腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌等

2.bcl-2過表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性如氮介、VP-16、卡鉑、氨甲喋呤和環(huán)磷酰胺等.3.許多化療藥物可抑制Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其它腫瘤1.黑色素瘤(Melanoma,一種惡性皮膚癌）Apaf-1的表達(dá)下降，從而抑制細(xì)胞凋亡。2.肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞等可以產(chǎn)生一種可溶性的Fas（Fas的胞外區(qū)），可與FasL結(jié)合并抑制其誘導(dǎo)的凋亡。二細(xì)胞凋亡與腫瘤的治療

1細(xì)胞凋亡與腫瘤的放療放療對腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用，是目前腫瘤治療常用的手段。其作用機(jī)理之一是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。放療引起的細(xì)胞凋亡可能涉及p53,bcl-2和Bax等基因的參與。

細(xì)胞凋亡(死亡受體途徑)

放射線P53

Baxbcl-2(線粒體途徑)

2細(xì)胞凋亡與腫瘤的化療：大多數(shù)化療藥物如烷化劑，順鉑，氮芥類化合物，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑以及紫杉醇等都可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。不同的化療藥物誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，作用機(jī)理也不同。如植物酚和植物黃酮類化合物（大豆黃酮/植物雌激素，姜黃素等）可以抑制雄激素受體的表達(dá)，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。三細(xì)胞凋亡與腫瘤的基因治療1通過反義核酸技術(shù)抑制凋亡抑制基因如bcl-2等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞凋亡活化基因如

caspase、bax、bad、p53等，使其過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。四細(xì)胞凋亡與AIDSAIDS病的一個重要標(biāo)志是患者血液中的CD4T細(xì)胞的數(shù)目顯著減少（正常人的CD4T細(xì)胞的數(shù)目是1000/μlblood)，當(dāng)患者該細(xì)胞數(shù)目減少到200/μl，患者不能產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，開始遭受各種危險的感染。由HIV引起的AIDS發(fā)病機(jī)制主要是宿主CD4+T細(xì)胞被選擇性破壞,導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞顯著減少。此外，HIV也可誘導(dǎo)其他免疫細(xì)胞如B細(xì)胞、CD8+淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞凋亡，因而造成機(jī)體免疫功能嚴(yán)重缺陷，患者容易繼發(fā)各種感染及惡性腫瘤而死亡。五細(xì)胞凋亡與器官移植

在器官移植中的應(yīng)用--------

通過分子生物學(xué)的方法使被移植的器官(如腎臟、肝臟和心臟細(xì)胞等)表達(dá)高水平的FasL，F(xiàn)asL可與T細(xì)胞表面的Fas結(jié)合并殺死T細(xì)胞，從而使被移植器官免受機(jī)體T細(xì)胞的進(jìn)攻，再加上使用免疫抑制藥物，這樣可以減少免疫排斥反應(yīng)。一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。（2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。第五節(jié)細(xì)胞凋亡的檢測二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。

Annexin-V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidineiodide,PI):

是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。三、線粒體膜勢能的檢測線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。四、DNA片斷化檢測細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,

染色質(zhì)DNA在核小體單位之