第03章細胞生物學研究方法課件

第三章細胞生物學研究方法細胞生物學研究思路進行初步觀察形成可驗證的假說設(shè)計對照試驗收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana生物學研究模式生物生物學研究模式生物微生物細胞病毒孟加拉斑馬魚熒光斑馬魚全身透明斑馬魚不同物種享有共同分子機制第三章細胞生物學研究方法

細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細胞組分的分析方法

細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)普通復式光學顯微鏡光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離。熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）

原理與應用

直接熒光標記技術(shù)

間接免疫熒光標記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

熒光顯微鏡技術(shù)原理體視熒光顯微鏡微管呈綠色、微絲紅色、核藍色直接熒光標記技術(shù)現(xiàn)代生物學的北斗星2008年度諾貝爾化學獎授予美國科學家下村修、馬丁-查爾菲，華裔化學家錢永健，他們因為發(fā)現(xiàn)和發(fā)展綠色熒光蛋白(GFP)而獲獎的。多種顏色熒光的大腸桿菌組成的“錢氏實驗室”字樣

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)原理

應用：

1.排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，高品質(zhì)的熒光成像;2.多維觀察,重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu);3.可進行一二三標記;4.動、靜態(tài)觀察；

5.定性與定量分析。

實例美國哈佛大學的吉恩·里維特(JeanLivet)使用共焦顯微技術(shù)(confocalmicroscopy)，拍攝了一只基因工程小鼠的腦干組織切片(厚340μm)。(即“腦虹”技術(shù)，Brainbow)美國北卡羅來納大學惠明頓分校的索尼婭·派奧特(SonjaPyott)拍攝到了小鼠內(nèi)耳毛細胞

.毛細胞為綠色，與毛細胞有突觸聯(lián)系的細胞為紅色，藍色的則是細胞核

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細胞中較大的細胞器AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）計算機輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細胞中的顆粒及細胞器的運動。二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識

電鏡與光鏡的比較

電鏡與光鏡光路圖比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負染色技術(shù)

冰凍蝕刻技術(shù)

超薄切片技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

SPM(Scanningprobemicroscope)電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造主要電鏡制樣技術(shù)

超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負染色技術(shù)（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細結(jié)構(gòu)

冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。 快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）

電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計算機圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應用前景的一門新技術(shù)。 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當前結(jié)構(gòu)生物學（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實驗手段。Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).掃描電鏡

原理與應用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題掃描電鏡外觀三、掃描隧道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)

包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。

裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。

特點：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復雜計算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.01nm）； （2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。 （4）可連續(xù)成像，進行動態(tài)觀察

用途：納米生物學研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。透射電鏡外觀

透射電鏡下的細胞

活細胞工作站可實現(xiàn)在細胞水平上的定性和定量分析、活細胞圖像處理、活細胞動態(tài)示蹤。在分子水平，可做到基因定位定量表達的動態(tài)分析、蛋白質(zhì)合成降解運輸和相互作用的動態(tài)研究、細胞骨架的代謝動力學測定和細胞周期各時相的動態(tài)觀察等。

現(xiàn)在市場上使用的活細胞工作站由高級自動倒置顯微鏡、活細胞長時間孵育系統(tǒng)、Z軸微光切系統(tǒng)（數(shù)碼共聚焦系統(tǒng)）、單色儀、高靈敏冷CCD、圖像軟件工作站組成。還需要加熱控制器；溫度控制器；CO2控制器；CO2培養(yǎng)箱。用于培養(yǎng)狀態(tài)下細胞動態(tài)的研究。儀器可以自動聚焦、單細胞追蹤、多位點成像。成像速度高、圖像清晰度高。四、活細胞工作站用途：1、活細胞熒光標記蛋白的長時程失蹤觀察2、活細胞運動分化形態(tài)示蹤觀察3、熒光共定位4、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）5、熒光圖像處理、測量第二節(jié)細胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細胞化學分析技術(shù)一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物

差速離心：分離密度不同的細胞組分

密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離差速離心A等速度沉降B等密度沉降密度梯度離心二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。

FeulgenStaining三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

蛋白電泳(SDS)

與免疫印跡反應(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：

免疫鐵蛋白技術(shù)

免疫酶標技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)

應用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標記或熒光素標記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結(jié)合）

PCR技術(shù)

人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片五、放射自顯影技術(shù)

原理及應用：

利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究；

實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)研究和追蹤。

步驟：

前體物摻入細胞（標記：持續(xù)標記和脈沖標記）

———放射自顯影六．定量細胞化學分析技術(shù)

細胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）

利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法

流式細胞儀（FlowCytometry）

主要應用：用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量； 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

流式細胞術(shù)第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與

顯微操作技術(shù)

細胞的培養(yǎng)

細胞工程一、細胞的培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細胞（primaryculturecell） 繼代培養(yǎng)細胞（sub-culturecell）

細胞系（cellline）有限細胞系，永生細胞系

細胞株（cellstrain）

植物細胞

類型：

原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細胞培養(yǎng)）

單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）

非細胞體系（cell-freesystem）

細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞系有限與無限細胞系如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細胞株和細胞系？多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養(yǎng)獲得細胞細胞的全能性細胞株、細胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果或細胞產(chǎn)物快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目植物細胞和動物細胞培養(yǎng)的比較動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。（3）用于檢測有毒物質(zhì)（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預防疾病提供理論依據(jù)這只老鼠身上的“人耳”是由我國科學家曹誼林教授利用細胞工程技術(shù)復制出來的。

二、細胞工程

細胞融合（cellfusion）與細胞雜交（cellhybridization）技術(shù)

單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)

細胞拆合與顯微操作技術(shù)

物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)(圖1、圖2)

化學法結(jié)合離心技術(shù)

制備核體（karyoplast）和胞質(zhì)體（cytoplast）。

其它技術(shù)遺傳分析（mutant,knockout,knockin）

對細胞生命活動的研究成為當今生命科學發(fā)展的瓶頸主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學（聚乙二醇）誘導方法使細胞分散后誘導細胞融合去除細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性細胞融合的原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目比較項目（一）植物、動物細胞融合的比較細胞融合單克隆抗體技術(shù)(二)單克隆抗體提出問題：長期以來，人們?yōu)榱双@得抗體，采用的是把某種抗原反復注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應不夠靈敏。單克隆抗體的概念（1）為什么用小鼠骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合？思考：（2）單克隆抗體制備過程中應用哪些細胞工程技術(shù)手段？（3）制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選？單克隆抗體有何應用？

主要用于疾病的診斷、治療和預防。與常規(guī)抗體相比，具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識別“自己”與“異己”，一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導彈”，將藥物定向帶到癌細胞所在部位，既消滅了癌細胞又不會傷害健康細胞。

絕大多數(shù)的單克隆抗體(mAb)是用小鼠開發(fā)的，雖然可作為研究和診斷的工具，但它們至少在一定程度上不是理想的治療劑，因為它們在人類中有免疫原性。也就是說，小鼠抗體引入到病人體內(nèi)，將被病人的免疫系統(tǒng)識別為外源物質(zhì)，并將發(fā)生有損治療抗體利用的人抗鼠抗體(HAMA)應答。已經(jīng)通過將這些鼠的抗體人源化或直接制備人的mAb來解決。

最近，通過用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因創(chuàng)建了產(chǎn)生人