實(shí)驗(yàn)十五：酸性磷酸酶的顯示課件

實(shí)驗(yàn)十一：細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的顯示方法——酸性磷酸酶的顯示【課前預(yù)習(xí)】1．溶酶體分為幾類，各有何特點(diǎn)？2．溶酶體是如何形成的？其標(biāo)志酶是什么？如何在顯微鏡下顯示？3．溶酶體具有哪些功能？【目的要求】1．熟悉酸性磷酸酶顯示方法的原理及操作步驟2．觀察酸性磷酸酶在細(xì)胞中的分布【基本原理】1．細(xì)胞化學(xué)：細(xì)胞化學(xué)是在保持細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用已知的化學(xué)反應(yīng)原位顯示細(xì)胞內(nèi)的某種化學(xué)成分，然后通過顯微鏡進(jìn)行定性、定位、定量研究的科學(xué)。2．細(xì)胞化學(xué)技術(shù)要求：保持樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變；保存細(xì)胞內(nèi)生前化學(xué)成分及酶的活性；顯示成分的化學(xué)反應(yīng)必須對將被顯示的化學(xué)物質(zhì)有高度特異性和高度靈敏性；反應(yīng)所生成的產(chǎn)物要在原位沉淀、顯色明顯、不溶、不擴(kuò)散，并在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中結(jié)果一致。3．染色的作用：由于正常的生物組織是無色透明的，因此無法在光鏡下進(jìn)行觀察。因此必須要對樣品進(jìn)行染色；染色劑可以滲透到組織的間隙中，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等成份可以吸附不同的色素粒子；染色劑中的陽離子和陰離子可分別與細(xì)胞中的酸性、堿性物質(zhì)相結(jié)合。染色就是根據(jù)這些原理，利用染色劑與細(xì)胞內(nèi)含物的物理作用與化學(xué)作用，將細(xì)胞和組織染成各種不同的顏色；由于染色劑的化學(xué)性質(zhì)不同，以及固定材料時(shí)所用的固定劑不同，染色劑對被染色的組織有一定的選擇性，從而使某些部位染色很清楚，而另一些部位可能完全不著色。例如，有些染色劑可染細(xì)胞核，有些染色劑可染細(xì)胞質(zhì)。4．染色的方法：（1）利用化學(xué)原理進(jìn)行的染色方法：金屬沉淀法：利用酶催化反應(yīng)形成的分解產(chǎn)物與金屬化合物反應(yīng)，最終生成有色沉淀，借此辨認(rèn)所要檢查的酶的活性。偶氮偶聯(lián)法：用人工合成的酶底物在酶的作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結(jié)合形成不溶性的偶氮色素。Schiff反應(yīng)法：游離的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)樽霞t色產(chǎn)物，這種反應(yīng)通常用于顯示多糖類（PAS反應(yīng)）和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。聯(lián)苯胺法：過氧化物酶分解H2O2產(chǎn)生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。四唑鹽顯示脫氫酶；（2）利用物理學(xué)原理進(jìn)行的染色：脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。熒光分析：借某些物質(zhì)可被紫外線激發(fā)產(chǎn)生可見熒光而被顯示。也可用熒光染色法將特定的熒光染料對細(xì)胞中的化學(xué)成分染色，在熒光顯微鏡下對這些成分進(jìn)行直接觀察。放射自顯影技術(shù)：用放射性核素標(biāo)記化合物，使其在細(xì)胞中參與代謝，將帶有標(biāo)記的代謝產(chǎn)物通過放射自顯影技術(shù)顯示出來，借以探測物質(zhì)代謝途徑和細(xì)胞增殖周期；（3）利用免疫學(xué)原理的染色方法：大分子物質(zhì)具有免疫原性可制備特異抗體。用各種標(biāo)記物如熒光素、辣根過氧化物酶和膠體金等標(biāo)記該抗體，利用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)原理，用標(biāo)記抗體顯示相應(yīng)抗原。5．酸性磷酸酶的顯示方法：酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）主要存在于巨噬細(xì)胞，定位于溶酶體內(nèi)。在溶酶體膜穩(wěn)定完整時(shí)，底物不易滲入，ACP活力微弱或無活性，經(jīng)固定，在合適pH條件下，膜本身變?yōu)椴环€(wěn)定，逐漸改變其滲透性，底物可以滲入，酶活力被顯示。ACP在酸性條件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷酸鈉的磷酸根解離出來，進(jìn)而與溶液中硝酸鉛結(jié)合形成磷酸鉛沉淀，因其是難溶解的無色沉淀物，需要與黃色的硫化銨作用，生成棕黑色PbS沉淀而被顯示出來。β-甘油磷酸鈉甘油+PO3-PO4+Pb（NO3)2Pb2（PO4)2Pb2（PO4)4+（NH4)2SPbS【實(shí)驗(yàn)用品】1．器材：注射器、解剖用具、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片2．試劑：3%淀粉溶液；ACP作用液；2%硫化銨Gomori硝酸鉛作用液0.05mol／L醋酸緩沖液（pH5)lOOml0.6醋酸加蒸餾水200ml、取其42ml醋酸鈉1.36g加蒸餾水200ml，取其158ml共200mlB-甘油磷酸鈉2g醋酸鉛2g5％氯化鎂5ml以上作用液在臨用時(shí)配制，最終在pH5～5.2，過濾使用。3．材料：小鼠腹腔液涂片【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】酸性磷酸酶活性結(jié)構(gòu)呈棕黃色至棕黑色。對照：在處理過程中，