酶制劑質(zhì)量要求 第3部分：α-淀粉酶制劑 征求意見稿

GB/T23527.3—XXXX酶制劑質(zhì)量要求第3部分：淀粉酶制劑本文件規(guī)定了α-淀粉酶制劑和β-淀粉酶制劑的術(shù)語和定義、產(chǎn)品分類、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存要求。本文件適用于α-淀粉酶制劑和β-淀粉酶制劑的生產(chǎn)、檢驗(yàn)和銷售。2規(guī)范性引用文件下列文件的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期的對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T601化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備GB/T602化學(xué)試劑雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法QB/T1803工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1α-淀粉酶alpha-amylase能水解淀粉分子鏈中的α-1,4-葡萄糖苷鍵，將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精和少量麥芽糖和葡萄糖，使淀粉粘度迅速下降的酶。3.2β-淀粉酶beta-amylase能從淀粉分子的非還原性末端開始依次水解α-1,4-葡萄糖苷鍵，并發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)，獲得麥芽糖的3.3α-淀粉酶制劑alpha-amylasepreparations以α-淀粉酶為主要催化活性組分，通過制劑等工藝制得的產(chǎn)品。3.4β-淀粉酶制劑beta-amylasepreparations以β-淀粉酶為主要催化活性組分，通過制劑等工藝制得的產(chǎn)品。GB/T23527.3—XXXX3.5α-淀粉酶活力單位activeunitofalpha-amylase1g固體酶粉（或1mL液體酶），在一定溫度和pH條件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即為1個(gè)酶活力單位，以“U”表示。注：也可根據(jù)所采用的酶活力測定方法，另行3.6中溫α-淀粉酶活力單位activeunitofalpha-amylase1g固體酶粉（或1mL液體酶），在60℃和pH6.0條件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即為1個(gè)酶活力單位，以“U”表示。3.7耐高溫α-淀粉酶活力單位activeunitofalpha-amylase1g固體酶粉（或1mL液體酶），在70℃和pH6.0條件下，1min液化1mg可溶性淀粉所需的酶量，即為1個(gè)酶活力單位，以“U”表示。3.8β-淀粉酶活力單位activeunitofbeta-amylase1g固體酶粉（或1mL液體酶），在50℃,pH5.50條件下，1h水解可溶性淀粉生成1g麥芽糖所需的酶量，即為1個(gè)酶活力單位，以“U”表示。注：也可根據(jù)所采用的酶活力測定方法，另行3.9α-淀粉酶活力alpha-amylaseactivityα-淀粉酶制劑活力activityofalpha-amylasepreparations催化淀粉水解為短鏈糊精和少量麥芽糖和葡萄糖，使淀粉粘度迅速下降的能力，表示為1g固體α-淀粉酶制劑（或1mL液體α-淀粉酶制劑）含有的酶活力單位。3.10β-淀粉酶活力beta-amylaseactivityβ-淀粉酶制劑活力activityofbeta-amylasepreparations能從淀粉分子的非還原性末端開始依次水解α-1,4-葡萄糖苷鍵，并發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)，獲得β-麥芽糖的能力，表示為1g固體β-淀粉酶制劑（或1mL液體β-淀粉酶制劑）含有的酶活力單位。4產(chǎn)品分類4.1按產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域分為食品工業(yè)用和其他工業(yè)用。4.2α-淀粉酶制劑按產(chǎn)品的適用溫度分為中溫α-淀粉酶制劑和耐高溫α-淀粉酶制劑。4.3按產(chǎn)品形態(tài)分為液體劑型酶制劑和固體劑型酶制劑。5要求5.1感官要求GB/T23527.3—XXXX應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1感官要求5.2理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標(biāo)β-淀粉酶制劑酶活力a/[U/mL（或U/g）]≥細(xì)度（通過網(wǎng)孔尺寸0.40mm的試驗(yàn)篩）b/%≥--干燥失重/%---a可按供需雙方合同規(guī)定的酶活力規(guī)格執(zhí)行，提供相應(yīng)6試驗(yàn)方法6.1一般要求本方法中所用的水，在未注明其他要求時(shí)，應(yīng)符合GB/T6682中水的規(guī)格，所用試劑，在未注明其他規(guī)格時(shí)，均指分析純。分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑及制品，在沒有注明其他要求時(shí)，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備。6.2感官要求取適量樣品，置于清潔、干燥的白瓷盤中，在自然光線下，觀察其色澤和狀態(tài)，并嗅其氣味。6.3酶活力α-淀粉酶（細(xì)菌來源）活力按附錄A進(jìn)行檢測，α-淀粉酶（真菌來源）活力按附錄B。α-淀粉酶也可參考附錄C或采用其他方法進(jìn)行檢測；β-淀粉酶活力按附錄D和附錄E進(jìn)行檢測，或采用其他方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果應(yīng)標(biāo)明測定的方法。必要時(shí)，還應(yīng)標(biāo)明緩沖溶液和底物。6.4細(xì)度（通過網(wǎng)孔尺寸0.40mm的試驗(yàn)篩）按QB/T1803-2023中細(xì)度的試驗(yàn)方法執(zhí)行，標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)篩為網(wǎng)孔尺寸為0.40mm的試驗(yàn)金屬絲編織網(wǎng)篩（SSW0.40/0.250mm，相當(dāng)于39目）6.5干燥失重按QB/T1803-2023中干燥失重的試驗(yàn)方法執(zhí)行。6.6耐高溫保存率6.6.1試劑和溶液GB/T23527.3—XXXX6.6.1.1氫氧化鈉溶液[c(NaOH)=0.1mol/L]：按GB/T601配制。6.6.1.2糊精溶液：稱取100.0g糊精于燒杯中，加水300mL，攪勻，加入1300U耐高溫α-淀粉酶制劑，置于電爐上加熱至沸騰，冷卻，用氫氧化鈉溶液（6.6.1.1）調(diào)pH值至6.0~7.0，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶，以水定容，搖勻備用。6.6.2儀器和設(shè)備6.6.2.1恒溫水?。壕取?.1℃。6.6.3分析步驟6.6.3.1待測酶液的制備除用糊精溶液（6.6.1.2）代替磷酸緩沖溶液外，其余同附錄A.4.2。6.6.3.2熱處理吸取25mL待測酶液于50mL比色管中，置于95℃恒溫水浴中熱處理60min，冷卻至室溫后，補(bǔ)水至25mL，混勻，備用。6.6.3.3酶活力測定按照附錄A分別測定熱處理前后的酶活力。6.6.4計(jì)算耐熱性存活率按式（1）計(jì)算：X1=E1/E×100....................................................................（1）式中：X1——樣品酶耐熱性存活率，%；E1——樣品熱處理后測得的酶活力，U/mL（或U/g）；E——樣品熱處理前測得的酶活力，U/mL（或U/g）。所得結(jié)果表示至整數(shù)。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1批次同原料、同配方、同工藝、同生產(chǎn)線連續(xù)生產(chǎn)的產(chǎn)品為一批。7.2抽樣抽樣的樣本量可按照表3執(zhí)行，或由生產(chǎn)企業(yè)和（或）相關(guān)方確定。每個(gè)最小外包裝單位的取樣量應(yīng)不小于300g（或300mL），不足按照比例適當(dāng)加取。充分混合均勻后檢驗(yàn)。7.3抽樣的樣本量23>5004注：批量范圍是指批中所包含的最小外包裝單位數(shù)量。抽樣的樣本量是指抽取樣本的最7.4出廠檢驗(yàn)7.4.1產(chǎn)品出廠前，應(yīng)由生產(chǎn)廠的質(zhì)檢部門負(fù)責(zé)按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定逐批進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)符合本文件后方可出7.4.2檢驗(yàn)項(xiàng)目——固體劑型的檢驗(yàn)項(xiàng)目：感官要求、酶活力、干燥失重、細(xì)度。GB/T23527.3—XXXX——液體劑型的檢驗(yàn)項(xiàng)目：感官要求、酶活力。7.5型式檢驗(yàn)檢驗(yàn)項(xiàng)目：本標(biāo)準(zhǔn)中全部要求項(xiàng)目。一般情況下，同一類產(chǎn)品的型式檢驗(yàn)每年至少進(jìn)行一次，有下列情況之一者，亦應(yīng)進(jìn)行：a）原輔材料有較大變化時(shí)；b）更改關(guān)鍵工藝或設(shè)備；c）新試制的產(chǎn)品或正常生產(chǎn)的產(chǎn)品停產(chǎn)3個(gè)月后，重新恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)；d）出廠檢驗(yàn)與上次型式檢驗(yàn)結(jié)果有較大差異時(shí)；e）國家監(jiān)督機(jī)構(gòu)按有關(guān)規(guī)定需要抽檢時(shí)。7.6判定規(guī)則7.6.1抽取樣品經(jīng)檢驗(yàn)，所檢項(xiàng)目全部符合要求，判該批產(chǎn)品符合本文件。7.6.2檢驗(yàn)結(jié)果如有兩項(xiàng)以上指標(biāo)不符合要求，判定該批產(chǎn)品不符合本文件。如有一項(xiàng)至兩項(xiàng)不符合要求，應(yīng)重新自同批產(chǎn)品中抽取樣本量的兩倍進(jìn)行復(fù)檢，以復(fù)檢結(jié)果為準(zhǔn)。若仍有一項(xiàng)不符合要求，判定該批產(chǎn)品不符合本文件。7.6.3當(dāng)供需雙方對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果有異議時(shí)，可由雙方協(xié)商解決，或委托有關(guān)單位進(jìn)行仲裁檢驗(yàn)，以仲裁檢驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。8標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存8.1標(biāo)志8.1.1銷售包裝使用標(biāo)簽時(shí)，應(yīng)標(biāo)注產(chǎn)品類型和酶活力。8.1.2包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志應(yīng)符合GB/T191的要求。8.2包裝包裝容器應(yīng)整潔、無破損。8.3運(yùn)輸運(yùn)輸工具應(yīng)清潔衛(wèi)生。不得與有毒、有害、有腐蝕性和含有異味的物品混裝、混運(yùn)，應(yīng)避免受潮、受壓、暴曬。裝卸時(shí)，應(yīng)輕拿輕放，不得直接鉤扎包裝。8.4貯存應(yīng)儲(chǔ)存在通風(fēng)、干燥、清潔的環(huán)境中，嚴(yán)防日曬雨淋，嚴(yán)禁火種。不得與有毒、有害、有腐蝕性和含有異味的物品混放。GB/T23527.3—XXXX附錄A（規(guī)范性）α-淀粉酶制劑酶活力分光光度計(jì)法A.1原理α-淀粉酶制劑能將淀粉分子鏈中的α-1,4葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對(duì)碘呈藍(lán)紫色的特性反應(yīng)逐漸消失，呈現(xiàn)棕紅色，其顏色消失的速度與酶活性有關(guān)，據(jù)此可通過反應(yīng)后的吸光度計(jì)算酶活力。A.2試劑和溶液A.2.1碘。A.2.2碘化鉀。A.2.3原碘液：稱取11.0g碘和22.0g碘化鉀，加入少量水完全溶解，定容至500mL，貯存于棕色瓶中。A.2.4稀碘液：吸取2.00mL原碘液（A.2.3），加20.0g碘化鉀用水溶解并定容至500mL，貯存于棕色瓶中。A.2.5可溶性淀粉溶液（20g/L）：稱取2.00g（精確至0.001g）可溶性淀粉（以干基計(jì)）于燒杯中，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入70mL沸水中，然后用水分次沖洗裝燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻定容至100mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。A.2.6磷酸緩沖液（pH6.0）：稱取45.23g十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和8.07g一水合檸檬酸（C6H8O7·H2O），用水溶解并定容至1000mL。用pH計(jì)校正后使用。A.2.7鹽酸溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：按GB/T601配制。A.3儀器和設(shè)備除實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器外還有以下儀器和設(shè)備。A.3.1分光光度計(jì)。A.3.2恒溫水?。壕取?.1℃。A.3.3移液器。A.3.4試管：25mm×200mm。A.3.5秒表。A.4分析步驟A.4.1待測酶液的制備稱取1g~2g樣品（精確至0.0001g，或1.00mL酶液用少量磷酸緩沖液充分溶解，將上清液小心傾入容量瓶中，若有剩余殘?jiān)偌由倭苛姿峋彌_液充分研磨，最終樣品全部移入容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻。注：待測中溫α-淀粉酶酶液酶活力濃度控制在3.4U/mL~4.5U/mL范圍內(nèi)，待測耐高溫α-淀粉酶活力濃度控制在60A.4.2測定吸取20.0mL可溶性淀粉溶液于試管中，加人磷酸緩沖液5.00mL，搖勻后，置于60℃±0.2℃（耐高溫α-淀粉酶制劑置于70℃±0.2℃)恒溫水浴中預(yù)熱8min。GB/T23527.3—XXXX加入1.00mL稀釋好的待測酶液，立即計(jì)時(shí)，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min。立即用移液器吸取1.00mL反應(yīng)液，加到預(yù)先盛有0.5mL鹽酸溶液和5.00mL稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5mL鹽酸溶液和5.00mL稀碘液為空白，于660nm波長下，用10mm比色皿迅速測定其吸光值。根據(jù)吸光值查附錄E，求得測試酶液的濃度。A.5計(jì)算中溫α-淀粉酶制劑的酶活力X2，單位為U/mL或U/g，按公式（2）計(jì)算：2= （2）式中：X2—樣品的酶活力，單位為U/mL(或U/g)；c一根據(jù)吸光值查表獲得的酶濃度，U/mL(或U/g);n—樣品的稀釋倍數(shù)。所得結(jié)果表示至整數(shù)。耐高溫α-淀粉酶制劑的酶活力X3，單位為U/mL或U/g，按公式（3）計(jì)算：3= （3）式中：X2—樣品的酶活力，單位為U/mL(或U/g)；c一根據(jù)吸光值查表獲得的酶濃度，U/mL(或U/g)；n—樣品的稀釋倍數(shù)；16.67——根據(jù)酶活力定義計(jì)算的換算系數(shù)。所得結(jié)果表示至整數(shù)。A.6允許差在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。GB/T23527.3—XXXX（資料性）α-淀粉酶活力的測定滴定法B.1原理酶作用于淀粉溶液生成還原糖,然后加入費(fèi)林試劑,在加熱的情況下,定量生成氧化亞銅沉淀。再加入碘化鉀和硫酸后,生成游離碘。用硫代硫酸鈉滴定生成的游離碘可計(jì)算出還原糖的量。B.2試劑和材料B.2.1碘化鉀溶液（30%）：碘化鉀150g溶解于350mL水，保存在褐色試劑瓶中，避免陽光直射。B.2.2硫酸溶液（25%）：稱取硫酸125g緩慢加入375mL水中。B.2.3硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液[c(Na2S2O3)=0.05mol/L]：按照GB/T601配制，使用前稀釋2倍。B.2.4乙酸溶液（1.0mol/L）：稱取30.0g冰乙酸于盛有400mL水的500mL容量瓶中，以水定容并混合。B.2.5乙酸鈉溶液（1.0mol/L）：稱取41.0g乙酸鈉于500mL容量瓶中，加400mL水溶解后以水定容并混合。B.2.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（1.0mol/L，pH5.0）：乙酸鈉溶液中加入乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0±0.05。B.2.7可溶性淀粉溶液（5g/L稱取0.5g（精確至0.001g）可溶性淀粉（以干基計(jì)）于燒杯中，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入50mL沸水中，然后用水分次沖洗裝燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻后加入5mL乙酸鈉緩沖溶液，以水定容至100mL。B.2.8銅溶液：硫酸銅34.66g溶解于水中，定容至50B.2.10費(fèi)林試劑：稱取等體積混合銅溶液和酒石酸鉀鈉堿溶液，臨用現(xiàn)配。B.3分析步驟B.3.1樣品溶液的制備用水稀釋酶樣品，使滴定空白溶液和樣品溶液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積差在2mL~4mL之間。B.3.2測定分別吸取10mL可溶性淀粉溶液于兩個(gè)100mL錐形瓶中，40℃±0.5℃水浴10min~15min，分別加入1.0mL水（空白）和1.0mL樣品溶液。準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，加入4.0mL費(fèi)林試劑終止反應(yīng)。將錐形瓶置于電爐煮沸2min后，流水冷卻至室溫。隨后，依次加入2mL30%碘化鉀溶液和2mL25%的硫酸溶液?；靹蚝蠛?，硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液溶液滴定游離出的碘，以藍(lán)色消失為滴定終點(diǎn)T0和T30（mL）。B.4結(jié)果計(jì)算：.................................................X4——樣品的酶活力，單位為U/mL(或U/g)；T0——滴定空白溶液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升（mL）；GB/T23527.3—XXXXT30——滴定樣品溶液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升（mLf——硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液的校正系數(shù)；1.62——每毫升0.05mol/L硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于1.62mg葡萄糖；1/10——根據(jù)酶活定義，10mg葡萄糖的換算系數(shù)n—樣品的稀釋倍數(shù)；所得結(jié)果表示至整數(shù)。B.5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于算術(shù)平均值的5%。(資料性)α-淀粉酶活力的測定全自動(dòng)生化分析儀法C.1范圍本方法適用于用全自動(dòng)生化分析儀測定α-淀粉酶制劑中a-淀粉酶的活力。本方法不適用于洗滌劑等產(chǎn)品中a-淀粉酶活力的測定。樣品中所有能夠分解底物的淀粉酶在本試驗(yàn)中均會(huì)被測定，導(dǎo)致結(jié)果偏大。試樣中蛋白酶的存在會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果偏小。但若遵循配制步驟中所述的措施去預(yù)防，本方法仍可使用。C.2原理樣品中的a-淀粉酶和反應(yīng)試劑中的α-葡萄糖苷酶能水解底物[4,6-亞乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-a,D-麥芽庚糖苷(亞乙基-G7PNP)]形成葡萄糖，并同時(shí)產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基苯酚。對(duì)硝基苯酚的生成速度可以通過全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測。反應(yīng)速度和酶活力成比例。反應(yīng)過程見NO? E·G?-s+Gl-s·O-+G+氧化乙烯十二烷基醚溶液16.5mL,攪拌均勻。最后用水定容至1000mL。4℃~8℃條件下有效期2個(gè)月。C.3.2穩(wěn)定劑：氯化鈣溶液2.5mL,用水定容至250mL。臨用現(xiàn)配。到250mL。4℃~8℃條件下有效期為1年。C.4.1全自動(dòng)生化分析儀：要求帶有進(jìn)樣/攪拌系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)(37℃±0.3℃)和檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)要求在405nm下連續(xù)檢測吸光度的變化。C.4.3酸度計(jì)：精度為0.01。C.5分析C.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取一定量的已知活力a-淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.0005g)于100mL容量瓶，穩(wěn)定劑溶解并定容。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中a-淀粉酶的活力為60.345U/mL。GB/T23527.3—XXXX標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍宜在2.01U/mL~6.03U/mL。在此范圍之內(nèi)方法的使用者可以選擇5個(gè)不同的濃度配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)需≥0.995。根據(jù)產(chǎn)品特性的不同，方法的使用者可以選擇其他的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，但必須滿足以上的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)的要求。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用前配制，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。C.5.2標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的制備如可能，稱取另一個(gè)批次已知活力的α-淀粉酶作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液的配制方法同標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稀釋液中的酶活力約為25.0mU/mL。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液使用前配制。C.5.3空白使用穩(wěn)定劑（C.3.2）為空白。C.5.4樣品溶液的制備C.5.4.1α-淀粉酶試樣稱取一定量的酶樣品，用穩(wěn)定劑（C.3.2）溶解和稀釋。稀釋的倍數(shù)要使得最終稀釋液的酶活力在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍之內(nèi)。樣品的最小稀釋倍數(shù)為20。C.5.4.2含有蛋白酶的α-淀粉酶試樣對(duì)于含有蛋白酶的樣品，分析中應(yīng)加入苯基甲基黃酰氟溶液（C.3.2），以避免蛋白酶的干擾。在制備含有蛋白酶的α-淀粉酶試樣時(shí)，應(yīng)按照所使用的容量瓶體積的0.1%體積分?jǐn)?shù)加入苯基甲基黃酰氟溶液。其他配制過程同C.5.4.1。C.5.5自動(dòng)分析步驟和參考參數(shù)C.5.5.1步驟——將200μL的α-葡萄糖苷酶R-1(C.3.4)轉(zhuǎn)移到比色皿中；——分別將16μL的空白、標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照或樣品轉(zhuǎn)移到比色皿中；——上述兩種溶液的混合物在37℃保溫300s;——分別在每個(gè)比色皿中加入20μL的底物R-2(C.3.4),混合保溫180s后開始測定；——每隔18s測定一次吸光度，每個(gè)樣品共測7次。C.5.5.2參數(shù)C.5.5.2.1保溫周期溫度：37℃;時(shí)間：300s；α-葡萄糖苷酶R-1和試樣：200μL+16μL。C.5.5.2.2酶反應(yīng)周期溫度：37℃;時(shí)間：180s；底物R-2：20μL。C.5.5.2.3測定周期測定模式：動(dòng)力學(xué)法；波長：405nm；曲線類型：非線性；時(shí)間：120s；讀數(shù)：7次；間隔：18s。C.6結(jié)果的計(jì)算和表示C.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線。其中Y軸單位為“OD/min”，X軸單位為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的酶活力“mU/mL”。GB/T23527.3—XXXXC.6.2樣品酶活力的計(jì)算α-淀粉酶制劑的酶活力X5，單位為U/mL或U/g，按公式（5）計(jì)算：..............................................（5）式中：X5——樣品的酶活力，單位為U/mL(或U/g)；A——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品最終稀釋液的活力，單位為mU/mL；F——溶解樣品用的容量瓶體積，單位為毫升（mL）；D——稀釋倍數(shù)；m——樣品的質(zhì)量，單位為克（g）；1000——U和mU的換算系數(shù)。C.6.3結(jié)果的確認(rèn)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的試驗(yàn)值在可接受的范圍之內(nèi)，且標(biāo)準(zhǔn)曲線為穩(wěn)定上升的直線時(shí)，樣品的試驗(yàn)結(jié)果有效，可計(jì)算平均值。C.6.4結(jié)果的表示樣品的測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示。C.7精密度中間精密度為1.9%。8GB/T23527.3—XXXX（規(guī)范性）β-淀粉酶制劑酶活力的測定分光光度計(jì)法D.1原理β-淀粉酶制劑能將淀粉分子鏈中的α-1,4-葡萄糖苷鍵以兩個(gè)葡萄糖殘基為單位依次切斷成麥芽糖和β-糊精，生成的麥芽糖使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。用分光光度計(jì)于波長550nm下測定溶液的吸光度。酶活力與吸光度成正比，據(jù)此計(jì)算酶活力。D.2試劑和溶液D.2.1磷酸鹽緩沖液（0.02mol/L，pH5.5）：稱取0.14g十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和2.35g磷酸二氫鈉（NaH2PO4），加入950mL蒸餾水，磷酸氫二鈉溶液或磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至5.50±0.05后，蒸餾水定容至1000mL。D.2.2可溶性淀粉底物溶液（1.1%）：稱取1.10g（精確至0.001g）可溶性淀粉（以干基計(jì)）于燒杯中，用少量緩沖液調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入80mL沸水，攪拌加熱5min至完全透明，冷卻定容至100mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。D.2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.0mg/mL）：稱取于105℃~110℃干燥2h后的葡萄糖200mg（精確至0.1mg），用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至100mL。臨用現(xiàn)配。D.2.4葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL和5.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用緩沖液定容并混勻。每0.5mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中葡萄糖含量分別為0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg和0.5mg。D.2.5DNS溶液：稱取3.15g3，5-二硝基水楊酸，加入500mL蒸餾水，攪拌3s～5s，45℃水浴。然后緩慢加入100mL氫氧化鈉溶液（200g/L），同時(shí)不斷攪拌，直到全部溶解（注意：在加入氫氧化鈉溶液過程中，溶液溫度不超過48℃)。再緩慢加入91.0g四水酒石酸鉀鈉、2.50g苯酚和2.50g無水亞硫酸鈉。期間不斷攪拌，直到完全溶解。停止加熱并冷卻至室溫后，蒸餾水定容至1000mL。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲(chǔ)存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后使用，有效期為180天。警告：處理酸堿和配制DNS試劑時(shí)，應(yīng)在通風(fēng)櫥或通風(fēng)良好的房間進(jìn)行，戴上護(hù)目鏡和乳膠手套，一旦皮膚或眼睛接觸D.3儀器和設(shè)備D.3.1渦旋振蕩器。D.3.2電子天平。D.3.3移液槍。D.3.4酸度計(jì)。D.3.5秒表。D.3.6電熱恒溫水槽。D.3.7電爐。D.3.8分光光度計(jì)，可測定550nm波長下的吸光度。D.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制9GB/T23527.3—XXXX分別移取0.5mL磷酸鹽緩沖液（空白）和葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，加入1.5mLDNS試劑，混勻，沸水浴15min后取出。流水冷卻至室溫后，蒸餾水定容至10mL，搖勻。以空白管為對(duì)照，分光光度計(jì)分別測量550nm下吸光值。以葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。D.5分析步驟D.5.1樣品溶液的制備稱取1g~2g樣品（精確至0.0001g，或量取1.00mL酶液），用少量磷酸緩沖液充分溶解，將上清液小心傾入容量瓶中，若有剩余殘?jiān)?，再加少量磷酸緩沖液充分研磨，最終樣品全部移入容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻。待測酶活力濃度控制在30U/mL~55U/mL范圍內(nèi)。D.5.2操作程序按表D.1程序操作：表D.1操作程序分別移取0.5mL反應(yīng)液于預(yù)先裝有1.5mLDNS溶液D.6計(jì)算β-淀粉酶活力X6，單位為U/mL或U/g，按公式（6）計(jì)算。6=..........................................................（6）式中：X6——試樣β-淀粉酶的酶活力，單位為U/mL或U/g；c——反應(yīng)結(jié)束后，樣品溶液和空白的吸光值之差在標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的葡萄糖的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；1.9——葡萄糖換算成麥芽糖系數(shù)；2——30min和1h的換算系數(shù)；n——稀釋倍數(shù)；20——吸取0.5mL反應(yīng)液換算成10mL換算系數(shù)；1000——毫克和克的換算系數(shù)。D.7精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。GB/T23527.3—XXXX（資料性）β-淀粉酶制劑酶活力的測定滴定法E.1原理酶作用于淀粉溶液生成還原糖,然后加入索氏試劑,在加熱的情況下,定加入碘化鉀和硫酸后,生成游離碘。用硫代硫酸鈉滴定生成的游離碘E.2試劑和材料E.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（2mg/mL）：同D.2.3E.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.2g/L移取5.0mL