基因工程應(yīng)用概述

1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide1課程要求通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技術(shù)等。

總成績(jī)＝平時(shí)（20％）＋實(shí)驗(yàn)（30％）＋考試（50％）

平時(shí)成績(jī)(考查遲到、早退，課堂提問(wèn)、討論、遵守課堂紀(jì)律等方面)1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide2教材和參考文獻(xiàn)樓士林等，基因工程，科學(xué)出版社，2002吳乃虎，基因工程原理（第二版上、下冊(cè)），科學(xué)出版社，1998張惠展編著，1999年出版，《基因工程概論》，華東理工大學(xué)出版社。Watson,J.Detal.RecombinantDNA,W.H.FreemanandCompany,NewYork,2ed,1992RobertF.Weaver,MolecularBiology,科學(xué)出版社,2000（影印版）1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide3本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達(dá)第七章基因操作的基本技術(shù)第八章植物基因工程及應(yīng)用第九章動(dòng)物基因工程及應(yīng)用第十章醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide4第八章植物基因工程及應(yīng)用第一節(jié)高等植物的遺傳學(xué)特性第二節(jié)高等植物基因轉(zhuǎn)化第三節(jié)植物基因工程應(yīng)用第四節(jié)轉(zhuǎn)基因的安全性1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide5第一節(jié)高等植物的遺傳學(xué)特性

a.

遺傳操作的簡(jiǎn)易性

大多數(shù)高等植物可以開(kāi)花授粉，通?？僧a(chǎn)生大量的后代，所以即使是非常稀有的基因突變和基因重組事件，其遺傳后果也易被觀察。

b.

整株植物的再生性

植物細(xì)胞具有全能性，單個(gè)細(xì)胞可以在適當(dāng)激素濃度誘導(dǎo)下完成脫分化、再分化的過(guò)程，分化成為葉和根，莖，最終形成整株植株。所以轉(zhuǎn)化了外源基因的植物細(xì)胞可以再生形成完整的植株。

c.染色體的多倍體性

許多高等植物以多倍體的形式存在，大約三分之二的禾本科植物是多倍體，其染色體數(shù)目范圍從24至144不等！其特征是體細(xì)胞變異頻率高，在組織培養(yǎng)中植物細(xì)胞是遺傳不穩(wěn)定的。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide6第二節(jié)高等植物基因轉(zhuǎn)化一.植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法

植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類：一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。另一類是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide7二.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法

(一)農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與T-DNA的整合機(jī)制

幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。農(nóng)桿根瘤菌之所以會(huì)感染植物根部是因?yàn)橹参锔繐p傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir（Virulenceregion)基因的啟動(dòng)表達(dá)，Vir基因的產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的一段T－DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈T－DNA結(jié)合，形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。T－DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長(zhǎng)素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide8無(wú)限制地生長(zhǎng)與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚(yú)堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農(nóng)桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine），使農(nóng)桿菌生長(zhǎng)必需的物質(zhì)。

1.Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

在發(fā)現(xiàn)根瘤農(nóng)桿菌誘發(fā)冠癭瘤的本質(zhì)是Ti質(zhì)粒后，Ti質(zhì)粒便成為冠癭瘤形成基因鑒定與分析的主要研究對(duì)象。

Ti質(zhì)粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（regionencodingconjugation)和Ori區(qū)（originofreplication)。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide9Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide10表達(dá)載體pBIn19的結(jié)構(gòu)1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide11T-DNA上共有三套基因和左右兩個(gè)邊界，LB和RB是長(zhǎng)為25bp的末端反復(fù)重復(fù)順序，在切除及整合過(guò)程具有重要意義。

tms由兩個(gè)基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）

tmr由一個(gè)基因組成iptz：

tmt由若干基因構(gòu)成，合成稀有氨基酸衍生物，稱為opines。它有三個(gè)成員：

octopine＝精氨酸與丙酮酸的縮合物

Napaline＝精氨酸與－酮戊二酸的縮合物

Agropine＝谷氨酸與二環(huán)糖的縮合物

據(jù)此可將Ti質(zhì)粒分為三大類，感染的植物誘導(dǎo)合成這些有機(jī)堿，但不能利用它們，其分解酶基因在Ti質(zhì)粒上，分解產(chǎn)物為氨基酸和糖類，供根癌農(nóng)桿菌使用作為氮源及碳源。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide122.T-DNA的整合機(jī)制：

T-DNA的詳細(xì)整合機(jī)制尚不清楚，但有幾個(gè)環(huán)節(jié)是明確的：

T-DNA切除由Vir區(qū)編碼的特異性內(nèi)切酶完成，分別在LB和RB的第三個(gè)堿基和第四個(gè)堿基之間產(chǎn)生缺口，并形成單鏈T-DNA。

T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不對(duì)稱的，RB順序與整合有關(guān)，而LB無(wú)關(guān)。

T-DNA的整合可以是單拷貝的，也可以是多拷貝的，成串聯(lián)形式排列，但整合位點(diǎn)的特異性尚未確定。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide13T-DNA的整合機(jī)制1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide14(二).Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的戰(zhàn)略１.Ti質(zhì)粒的改造

有以下理由使天然的Ti質(zhì)粒不能作為表達(dá)載體使用：

a.生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)素和分裂素阻止了細(xì)胞再生長(zhǎng)為整株植物，因此，必須除去生長(zhǎng)素和分裂素基因。

b.有機(jī)堿的合成與T-DNA的轉(zhuǎn)化無(wú)關(guān)，而且可能會(huì)影響植物細(xì)胞生長(zhǎng)，因?yàn)橛袡C(jī)堿合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必須去除有機(jī)堿合成基因（tmt）

c.Ti質(zhì)粒約為200kb，重組操作非常困難，也很難找到單一的酶切位點(diǎn)。

1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide15d.Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制，為了使重組質(zhì)粒DNA的大量擴(kuò)增，須添加入大腸桿菌復(fù)制子。加入植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，如neor基因，使用植物細(xì)胞啟動(dòng)子及末端polyA化信號(hào)，加入多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。

植物中一般不存在質(zhì)粒，為利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，發(fā)展了共整合系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)，避免了在大的Ti質(zhì)粒上進(jìn)行分子重組操作的困難。

2.植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng)

T-DNA克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。T-DNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體DNA上，Kmr篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide16共整合載體1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide173.植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的雙元系統(tǒng)

目前T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)?？稍谵r(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來(lái)。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號(hào)啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上的Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的T-DNA切割下來(lái)，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide18雙元載體系統(tǒng)1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide19農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide20(三).改良植物性狀的策略基因克隆技術(shù)提供了一種新的改良植物的方法，它可以直接的改變植物的基因型。有兩種策略可以應(yīng)用。

1）基因附加：通過(guò)添加1個(gè)或多個(gè)基因改變植物的性狀。

2）基因扣除：利用基因工程技術(shù)使一個(gè)或多個(gè)植物已經(jīng)存在的基因失活。

滅活植物基因是通過(guò)反義技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將外源基因反向的連接到載體中，當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA后，與正常的mRNA是反向互補(bǔ)的。我們稱這種反向互補(bǔ)為反義RNA，縮寫(xiě)為asRNA。

反義RNA阻止原有基因表達(dá)的機(jī)理尚不明了，但可以肯定，正義和反義RNA之間的雜交與這一事件有關(guān)，可能雙鏈的RNA很快被核酸酶降解，或者反義RNA阻止了核糖體與正義RNA的結(jié)合。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide21反義技術(shù)的原理1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide221.基因附加的方法我們以抗蟲(chóng)基因?yàn)槔齺?lái)說(shuō)明。1.1

理想的殺蟲(chóng)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的是昆蟲(chóng)。為了減少損失，一般使用殺蟲(chóng)劑。大部分殺蟲(chóng)劑沒(méi)有選擇性，殺滅害蟲(chóng)的同時(shí)也消滅了天敵，同時(shí)對(duì)生物圈中的其他生物產(chǎn)生影響，包括人，污染了環(huán)境。有一些生物生長(zhǎng)在植物體內(nèi)，可以避免農(nóng)藥的傷害。理想的殺蟲(chóng)劑具有的特性:它必須對(duì)害蟲(chóng)有害，但毒性應(yīng)該有選擇性，對(duì)其他生物無(wú)害。殺蟲(chóng)劑能夠必降解，作物收獲后不存在殘留，并且對(duì)環(huán)境無(wú)污染。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide23可以保護(hù)整個(gè)植株，不單單是地上部，免受害蟲(chóng)危害。到目前為止，我們還未發(fā)現(xiàn)這樣的理想殺蟲(chóng)劑，最相近的是來(lái)自于蘇云金桿菌的δ-內(nèi)毒素。a)

蘇云金桿菌的δ-內(nèi)毒素蘇云金桿菌在孢子形成的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)形成殺蟲(chóng)晶體蛋白—稱為δ-內(nèi)毒素，其活性很強(qiáng)，有時(shí)要比有機(jī)磷毒性高80000倍，而且選擇性很強(qiáng)，不同品系的細(xì)菌和成不同的毒蛋白。在細(xì)菌中積累的δ-內(nèi)毒素是無(wú)活性的前體，昆蟲(chóng)食用后，前毒素被蛋白酶消化后產(chǎn)生有毒性的蛋白，結(jié)合到昆蟲(chóng)腸道內(nèi)，破壞表皮細(xì)胞，使昆蟲(chóng)不能進(jìn)食，從而饑餓而死。不同昆蟲(chóng)中，晶體結(jié)構(gòu)不同產(chǎn)生了特異性。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide24CryI 鱗翅目幼蟲(chóng)CryII 鱗翅目和雙翅目幼蟲(chóng)CryIII 鱗翅目CryIV 雙翅目CryV 線蟲(chóng)綱CryVI 線蟲(chóng)綱1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide25蘇云金桿菌并不是最近才發(fā)現(xiàn)的，早在1904年即開(kāi)始使用，可以作為無(wú)公害的殺蟲(chóng)劑，但他很容易降解，所以要不斷的補(bǔ)充，增加了農(nóng)民的成本。因此研究者試圖生產(chǎn)不需要連續(xù)補(bǔ)充的δ-內(nèi)毒素，一種方法是利用蛋白質(zhì)工程，修飾其蛋白結(jié)構(gòu)使其更加穩(wěn)定，另一種方法是通過(guò)基因工程是植物能夠合成自己的毒素。b)將δ-內(nèi)毒素克隆到玉米中傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑在玉米上效果較差，主要害蟲(chóng)是玉米螟，生物技術(shù)學(xué)家試圖獲得能合成δ-內(nèi)毒素的玉米。北卡萊羅納Ciba-Geigy實(shí)驗(yàn)室使用Cry1A(b)內(nèi)毒素，這是一個(gè)1155個(gè)氨基酸的蛋白，29-607位的片段具有毒性。Ciba-Geigy研究小組并沒(méi)有使用完整的基因，只使用了前648個(gè)密碼子，人工合成了這一片段，這樣可以對(duì)原始基因進(jìn)行修飾，使用玉米偏愛(ài)的密碼子。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide26原始基因中GC含量是38%,而人工基因的GC含量為65%。將人工基因連接到盒式載體上，后接一個(gè)來(lái)自于CaMV的多腺苷酸化信號(hào)，利用微粒轟擊法將其引入玉米的胚中。胚胎長(zhǎng)成植株后，利用PCR法鑒定。利用人工基因特異的片段作為PCR引物。下一步工作就是利用免疫技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因植株是否合成了δ-內(nèi)毒素，結(jié)果顯示人工基因確實(shí)具有活性。不同植株中產(chǎn)生的δ-內(nèi)毒素?cái)?shù)量不同，從250-1750ng/mg總蛋白，這種差異是由位置效應(yīng)引起的。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide27位置效應(yīng)1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide28轉(zhuǎn)基因植株是否對(duì)玉米螟有抗性呢？在田間調(diào)查了6周，應(yīng)用兩條標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量：害蟲(chóng)對(duì)植株總的危害，以及蟲(chóng)道的長(zhǎng)度。轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)了較好的抗蟲(chóng)效果，對(duì)照蟲(chóng)道長(zhǎng)度40.7cm,轉(zhuǎn)基因植株蟲(chóng)道只有6.3cm。1.2

其它的基因附加工程在水稻、棉花、馬鈴薯、番茄和其它作物上也進(jìn)行了δ-內(nèi)毒素工程，獲得昆蟲(chóng)抗性也不僅僅是指有著一種方法。蛋白酶抑制劑也是較好的選擇，它可以一只昆蟲(chóng)腸道內(nèi)的蛋白酶活性，阻止或減緩害蟲(chóng)生長(zhǎng)，許多植物能產(chǎn)生蛋白酶抑制劑，如豇豆和commonbean,他們的基因已經(jīng)被成功的轉(zhuǎn)移到其他植物中，但一般蛋白的表達(dá)量比較低。這種抑制劑對(duì)甲蟲(chóng)的效果非常明顯，所以對(duì)需要長(zhǎng)期貯存的種子作物是一種很好的選擇。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide292.基因扣除基因扣除（geneknockingout）這一詞語(yǔ)不是很恰當(dāng)，因?yàn)椴⒉蝗コ?，只是讓基因失活。有許多方法可以使基因失活，最成功的是反義技術(shù)。我們將以延長(zhǎng)貨架期的工程番茄為例進(jìn)行說(shuō)明。2.1反義技術(shù)的原理在一個(gè)反義實(shí)驗(yàn)中，克隆的基因是反向的連接到載體中，這意味著當(dāng)克隆的基因轉(zhuǎn)錄成mRNA后，與正常的mRNA是反向互補(bǔ)的。我們稱這種反向互補(bǔ)為反義RNA，有時(shí)縮寫(xiě)為asRNA。一個(gè)反義RNA阻止原有基因合成表達(dá)產(chǎn)物，我們尚不清楚其潛在的機(jī)理是什么，但可以肯定，正義和反義RNA之間雜交與這一事件有關(guān)，可能雙鏈的RNA很快被核酸酶降解，或者反義RNA阻止了核糖體與正義RNA的結(jié)合。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide302.2利用反義RNA延遲番茄果實(shí)的成熟美國(guó)的Calgene公司和英國(guó)的ICI種子公司利用反義技術(shù)改造番茄，延長(zhǎng)其貨架期。a)

多聚半乳糖醛酸酶在番茄果實(shí)成熟過(guò)程中的作用番茄從開(kāi)花到收獲需要大約8周的時(shí)間，第6周開(kāi)始，果實(shí)的顏色和風(fēng)味開(kāi)始變化，此時(shí)成熟過(guò)程的基因開(kāi)始啟動(dòng)，包括多聚半乳糖醛酸酶，使果實(shí)開(kāi)始軟化。運(yùn)輸過(guò)程中，造成傷害，降低了商品品質(zhì)。b)

克隆多聚半乳糖醛酸酶基因在1980s中期，ICI種子公司的生物技術(shù)部與Nottinghan大學(xué)合作進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。從正常多聚半乳糖醛酸酶基因的5’端獲得了一個(gè)730bp的限制性片斷，包含了一半的編碼序列，將植物的多腺苷酸化信號(hào)連接到片段的頭部，CaMV啟動(dòng)子連接到尾部，插入Ti質(zhì)粒pBIN19中。引入植物后，轉(zhuǎn)錄后形成了反義RNA。降低了多聚半乳糖醛酸酶基因的表達(dá)。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide31延遲成熟番茄的構(gòu)建過(guò)程1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide321/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide33pBIN19分子重組到根癌農(nóng)桿菌中，用來(lái)侵染番茄莖端，轉(zhuǎn)移到含kan的培養(yǎng)基中，再生形成了完整的植株。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過(guò)4個(gè)途徑分析：1

Southern雜交檢測(cè)反義基因2

Northern雜交檢測(cè)反義基因的轉(zhuǎn)錄，利用只能與反義RNA雜交的單鏈探針。3

反義基因?qū)φx多聚半乳糖醛酸酶基因表達(dá)量的影響，通過(guò)與正義RNA的Northern雜交檢測(cè)，使用與正義mRNA特異的探針。史研究顯示，轉(zhuǎn)基因植株的多聚半乳糖醛酸酶mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide344

聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，多聚半乳糖醛酸酶的表達(dá)量明顯降低。轉(zhuǎn)基因果實(shí)雖然也在逐漸的成熟，但可以存放很長(zhǎng)的時(shí)間。這意味著反義RNA雖然不能完全將多聚半乳糖醛酸酶基因失活，但可以有效的降低基因的表達(dá)量，延緩成熟過(guò)程。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide35轉(zhuǎn)基因番茄PG酶活性的變化1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide36三.病毒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化植物病毒廣泛存在，而且不受單子葉或雙子葉的限制。因此病毒作為植物基因工程的載體日益受到人們的重視。在已知300種特征清楚的植物病毒中，單鏈RNA病毒約占91%，雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。RNA不適合于作為克隆載體，因?yàn)镽NA的操作非常困難。在植物上已知有兩種DNA病毒，花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV）和雙聯(lián)體病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想載體。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide37花椰菜花葉病毒載體已用來(lái)克隆了一個(gè)基因進(jìn)入蕪箐甘藍(lán)，有兩個(gè)因素限制了其應(yīng)用：

1）花椰菜花葉病毒基因組的大小，即使是切除了非必須序列，花椰菜花葉病毒載體的承載插入片段的能力還是有限的，只能插入很小的片段。

2）花椰菜花葉病毒的寄主范圍非常窄，主要是蕓苔屬植物如蕪菁、甘藍(lán)和花椰菜等。

這類病毒比較有潛力侵染重要的作物，如玉米和小麥，然而在侵染過(guò)程中，這類病毒重新排列并刪除部分序列，攪亂插入的DNA序列。這種病毒可引起破壞性的侵染，需要嚴(yán)格的防護(hù)，防止載體從寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花葉病毒作為克隆載體還需要進(jìn)一步的改造。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide38四.基因槍轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌侵染雙子葉植物獲得轉(zhuǎn)基因植株是非常成功的，自然界中的農(nóng)桿菌只侵染雙子葉植物，對(duì)單子葉植物不敏感。雖然通過(guò)添加乙酰丁香酮類物質(zhì)可使農(nóng)桿菌侵染單子葉植物，但單子葉植物的再生比較困難，因而農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物仍然是比較困難的。1984年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，超螺旋結(jié)構(gòu)的細(xì)菌質(zhì)粒，雖然不能在植物細(xì)胞中復(fù)制，但可以重組整合到植物染色體內(nèi)。受這一現(xiàn)象的啟發(fā)產(chǎn)生基因直接轉(zhuǎn)移技術(shù)。重組機(jī)制并不清楚。因?yàn)榧?xì)菌質(zhì)粒與植物DNA之間沒(méi)有同源性。事實(shí)上整合是隨機(jī)的發(fā)生在植物染色體的任何位點(diǎn)。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide39植物基因直接轉(zhuǎn)移的原理1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide40基因槍（particlegun）又稱微彈轟擊法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。最早是由Cornell大學(xué)研制的火藥基因槍。1990年，美國(guó)杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統(tǒng)。基因槍的組成部分有：點(diǎn)火裝置、發(fā)射裝置、擋板、樣品室、真空系統(tǒng)組成?；驑屴D(zhuǎn)化的基本步驟如下：

DNA微彈的制備

DNA-微彈載體的制備

靶外植體準(zhǔn)備

DNA微彈轟擊

轟擊后外植體的培養(yǎng)

基因槍轉(zhuǎn)化率差異很大，一般在10-3~10-2之間。McCabe在大豆上高達(dá)2%，而有的報(bào)道僅有10-4。相對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率要低得多，而且基因槍轉(zhuǎn)化1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide41成本高；嵌合體比率大遺傳穩(wěn)定性差。即使這樣，該方法在單子葉植物上也有廣泛應(yīng)用，有如下優(yōu)點(diǎn)：

a)無(wú)宿主限制，無(wú)論是單子葉植物和雙子葉植物都可以應(yīng)用。

b)受體類型廣泛，原生質(zhì)體、葉圓片、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖、根、以及種子的胚、分省組織、愈傷組織、花粉細(xì)胞、子房等幾乎所有具有分生潛力的組織或細(xì)胞都可以用基因槍進(jìn)行轟擊。

c)可控度高，商品化的基因槍都可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)控微彈的速度和射入濃度，命中特定層次的細(xì)胞。

d)操作簡(jiǎn)便迅速。

正因?yàn)榛驑屵@些優(yōu)點(diǎn)，使基因槍成功的應(yīng)用于：植物基因轉(zhuǎn)化，特別是單子葉植物的轉(zhuǎn)化；外源基因?qū)胫参锛?xì)胞器；種質(zhì)轉(zhuǎn)化（莖尖分生組織、配子體、胚胎細(xì)胞）。

e)植物基因表達(dá)調(diào)控研究。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide42第三節(jié)植物基因工程的應(yīng)用一.利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因的表達(dá)與調(diào)控（一）轉(zhuǎn)報(bào)告基因研究植物基因的表達(dá)與調(diào)控

植物對(duì)環(huán)境中的光、重力等因素尤為敏感。這些因素均可誘導(dǎo)基因的表達(dá)。利用報(bào)告基因環(huán)境因素的變化對(duì)基因表達(dá)的影響，是植物分子生物學(xué)的重要內(nèi)容。在植物中常用的報(bào)告基因有：

I大腸桿菌的β－葡萄糖苷酸酶（GUS）:

相當(dāng)于在微生物及動(dòng)物系統(tǒng)中使用的β－半乳糖苷酶，只是其作用底物為葡萄糖苷酸。該酶在脊椎動(dòng)物和微生物中表達(dá)，植物細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。當(dāng)gus基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，若與X－葡萄糖苷酸酶（X-gluc，與X-gal相似），保溫后，就會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，借此可以預(yù)測(cè)報(bào)告基因表達(dá)程度，但是該酶不能分泌在細(xì)胞外，因此在測(cè)定酶活時(shí)，須將細(xì)胞殺死，破碎。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide43

II昆蟲(chóng)的熒光素酶基因：

植物活細(xì)胞基因表達(dá)的檢測(cè)可用昆蟲(chóng)的熒光素酶基因作為報(bào)告基因，其工作原理如下：

將昆蟲(chóng)熒光素和ATP表達(dá)熒光素酶的植物細(xì)胞混合，該酶催化昆蟲(chóng)熒光素的氧化反應(yīng)，并生成AMP、CO2和光，表達(dá)該酶的植物細(xì)胞或組織便可用感光膠片檢測(cè)。例如，葉子的表面用砂紙磨損然后注入含有昆蟲(chóng)熒光素和ATP的緩沖液中，晾干，將X－光膠片覆蓋在葉子上，則表達(dá)昆蟲(chóng)熒光素酶的細(xì)胞就會(huì)使膠片感光與同位素檢測(cè)方法一樣。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide44熒光素酶基因在植物中的表達(dá)1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide45（二）T-DNA插入滅活基因及克隆基因

Ti質(zhì)粒上的T-DNA能隨機(jī)整合入植物染色體中，因而已廣泛應(yīng)用于植物基因的定性及分離上。T-DNA插入某植物基因，便可導(dǎo)致其插入滅活，性狀發(fā)生改變。以此在體內(nèi)鑒定滅活基因的生物學(xué)功能。此外，T-DNA還可用于克隆植物基因。

將含有NPTII標(biāo)記基因的PBR322重組質(zhì)粒導(dǎo)入含有T-DNA兩側(cè)邊界順序的Ti質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，并將此菌侵染植物。獲得轉(zhuǎn)基因植物后，挑選各種突變株，并提取DNA，用SalI水解DNA，T-DNA區(qū)域及NPTII中無(wú)SalI切口，但pBR322上有一個(gè)SalI切口，位于Tcr基因內(nèi)，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，切下植物基因組片段，作探針雜交植物cDNA文庫(kù)，便可獲得滅活的整個(gè)植物基因。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide46(三）利用轉(zhuǎn)座元件克隆植物基因轉(zhuǎn)座子可以從基因組的一個(gè)位置移動(dòng)到另一個(gè)位置，如果插入到基因的編碼序列內(nèi)，可以導(dǎo)致基因的失活，導(dǎo)致形狀變異。目前已在多種植物中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的存在，如玉米的轉(zhuǎn)座子AC-DS系統(tǒng)，將這些轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入其他植物中，篩選變異株，就可以將相關(guān)的基因克隆出來(lái)。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide47二.利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)一旦植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展起來(lái)，人們就感興趣利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)及其它高分子化合物。

（一）異源蛋白藥物

利用哺乳類動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白藥物是極其昂貴的，而植物生長(zhǎng)成本較低，農(nóng)田里可換得大量蛋白質(zhì)藥物。目前這方面的項(xiàng)目仍在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行：如人的腦腓肽、人血清蛋白、及小鼠的單克隆抗體等。舉例說(shuō)明：

將小鼠的抗體輕鏈和重鏈基因分別在兩種煙草植物中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物由根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建。然后兩種植物品系雜交，產(chǎn)生的子代植物表達(dá)小鼠的重鏈輕鏈兩種蛋白。從煙草的葉子里可檢測(cè)到完整的抗體分子，含量為葉細(xì)胞蛋白總量的1.5%實(shí)驗(yàn)還表明，植物的蛋白分泌系統(tǒng)能夠識(shí)別小鼠抗體前體的信號(hào)肽順序。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide48（二）食用或工業(yè)用油首批大規(guī)模生產(chǎn)并取得商業(yè)效益的非食用性轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品是工業(yè)用油，其中包括制造肥皂和去垢劑的月桂酸（12個(gè)碳原子）?？茖W(xué)家們僅表達(dá)一個(gè)特殊的基因就使油菜生產(chǎn)月桂酸而不是通常的18個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸。這個(gè)實(shí)驗(yàn)田試驗(yàn)結(jié)果極其成功，經(jīng)濟(jì)效益顯著。此外，利用油菜易于生長(zhǎng)及產(chǎn)量高的特點(diǎn)，人們還致力于用它生產(chǎn)其它工業(yè)用油。如，作用潤(rùn)滑油及尼龍生產(chǎn)的原料芥酸；用于麥淇淋生產(chǎn)的6－十八碳烯酸等等。

（三）高分子材料

通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物獲得的高分子原材料范圍極其廣泛。包括：可被生物降解的聚羥丁酯塑料（PHB）以及天然棉花與聚酯的混合纖維等。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide49三.改良植物品種（一）控制果實(shí)成熟的轉(zhuǎn)基因植物

蔬菜和水果成熟后，其組織呼吸速度及乙烯合成速度普遍加快，并迅速導(dǎo)致果實(shí)皺縮和腐爛。通過(guò)基因工程抑制乙烯的合成和信號(hào)傳導(dǎo)，既可延長(zhǎng)果實(shí)的壽命及存架期，也為果實(shí)的運(yùn)輸提供了條件，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。

1990年和1991年，兩位科學(xué)家分別用反義RNA技術(shù)，分別抑制了番茄中的ACC合成酶基因及EFE基因的表達(dá)，乙烯合成分別抑制了97%和99.5%明顯增加了番茄的保存期。

目前有關(guān)的研究工作仍在繼續(xù)，并已擴(kuò)展到了草莓、梨、蘋(píng)果、香蕉、芒果、桃、甜瓜等。另外，切斷乙烯的信號(hào)傳導(dǎo)也可延緩轉(zhuǎn)基因果實(shí)的成熟，1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide50目前已經(jīng)克隆乙烯的受體基因CTR1和ETR1等，轉(zhuǎn)基因果實(shí)的成熟被大大延遲。

減少水果由于損傷（如機(jī)械搬運(yùn)）而變質(zhì)的另一種思路是：

植物尤其是成熟果實(shí)中表達(dá)大量的半乳糖醛酸酶（PG）。它能水解果膠而溶解植物的細(xì)胞壁，使成熟果實(shí)易于損傷，降低PG的表達(dá)量也能有效地減少果實(shí)的損傷。具體方法是：將PGcDNA5'端區(qū)域反向接在花椰菜花斑病毒（CaMV）啟動(dòng)子的下游。構(gòu)成表達(dá)PG反義RNA的基因。這個(gè)基因重組入大腸桿菌－根瘤農(nóng)桿菌的Ti穿梭質(zhì)粒上。通過(guò)根瘤桿菌進(jìn)入番茄細(xì)胞內(nèi)。這種轉(zhuǎn)基因番茄表達(dá)大量的PG反義RNA。顯著地減少了PG的活性，使番茄不易軟化破損腐爛，并成為首次上市的轉(zhuǎn)基因植物，其商標(biāo)為FLAVRSAVRTM。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide51（二）抗蟲(chóng)害的轉(zhuǎn)基因植物昆蟲(chóng)對(duì)農(nóng)作物的危害是極大的。在美國(guó)，農(nóng)場(chǎng)主每年花費(fèi)幾十億美元去對(duì)付危害農(nóng)作物的昆蟲(chóng)。目前對(duì)付昆蟲(chóng)的最主要武器仍是化學(xué)殺蟲(chóng)劑。這些農(nóng)藥不同程度地對(duì)人畜有害，污染環(huán)境。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可望培養(yǎng)出抗蟲(chóng)害的農(nóng)作物優(yōu)良品種。大致有三種戰(zhàn)略：

I含細(xì)菌內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建：

天然的微生物殺蟲(chóng)劑，如蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis,Bt）已用了三十年了。該細(xì)菌能產(chǎn)生一種結(jié)晶蛋白，編碼基因位于Bt中一個(gè)75kb的質(zhì)粒上?；虻谋磉_(dá)依賴于Bt孢子形成。這種結(jié)晶蛋白分子量約為125KD，對(duì)許多昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)表現(xiàn)毒性。但對(duì)成蟲(chóng)和脊髓動(dòng)物無(wú)作用。Bt合成的只是無(wú)活性的原毒素（1178aa.）。當(dāng)被幼蟲(chóng)進(jìn)食后，1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide52

其消化道中的蛋白酶便將毒素原蛋白水解成68kD的毒性片段。這個(gè)片段與幼蟲(chóng)中腸細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而干擾這些細(xì)胞的正常功能。然而靠商業(yè)生產(chǎn)Bt孢子是有限的，且毒性蛋白原在體外并不穩(wěn)定，因而保護(hù)期很短。最近含有修飾的毒性蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉已問(wèn)世。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide53

II蛋白酶抑制劑

BT轉(zhuǎn)基因植物容易產(chǎn)生抗性，而且抗蟲(chóng)譜較窄。胰蛋白酶抑制劑是廣泛存在于種子和塊莖中一類蛋白質(zhì)，在防御昆蟲(chóng)和病原菌侵染中起重要作用。其抗蟲(chóng)機(jī)理是：與昆蟲(chóng)消化道內(nèi)的蛋白消化酶結(jié)合，形成EI復(fù)合物，阻斷或減弱蛋白酶對(duì)外源蛋白的消化；EI還可以刺激昆蟲(chóng)過(guò)量分泌消化酶，產(chǎn)生厭食反應(yīng)。

胰蛋白酶抑制劑用于抗蟲(chóng)植物培育一般不會(huì)產(chǎn)生抗性，而且抗蟲(chóng)譜廣。但在植物中的表達(dá)強(qiáng)度較低，抗蟲(chóng)性不強(qiáng)。

III細(xì)菌毒素與絲氨酸酶蛋白酶抑制劑的混合植物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：混合比單獨(dú)毒素提高20倍。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide54（三）抗病的轉(zhuǎn)基因植物

1.抗病毒

農(nóng)作物感染病毒是個(gè)嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)問(wèn)題。感染導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量降低、質(zhì)量減退。構(gòu)建抗病毒轉(zhuǎn)基因植物有以下幾種策略：

I病毒外殼蛋白基因

Cp基因?qū)胫参锛?xì)胞后，可能以下述作用方式使植物獲得保護(hù)：（1）當(dāng)裸露的病毒遺傳物質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞后，立即被外殼蛋白包裝，阻止了病毒核酸的翻譯與復(fù)制。（2）在Cp水平上阻止病毒脫殼。TMV外殼蛋白CP的轉(zhuǎn)煙草植物，該轉(zhuǎn)基因植物在TMV存在條件下，能抗病毒感染30天左右，正常植物3~4天之后使被TMV感染。最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CP表達(dá)抵御病毒侵襲也在其它谷物中成功，如馬鈴薯、番茄、苜蓿等。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide55II轉(zhuǎn)表達(dá)復(fù)制酶亞基反義基因的植物：

將TMV5'端基因片段（含復(fù)制酶亞基因）作為目的基因，成功地構(gòu)建了其反義基因的轉(zhuǎn)煙草植株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，病毒RNA的合成抑制了25~50倍。系統(tǒng)的病毒侵染癥狀特征消失或大量減少。

此外，衛(wèi)星RNA、核糖體失活蛋白基因、干擾素也成功的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗病毒植物的培育。

2.抗細(xì)菌基因工程

細(xì)菌性病害防治較為困難，藥劑常常不能完全奏效，同時(shí)又易造成環(huán)境污染。某些情況下，作物本身缺乏抗性材料，限制了抗病育種的發(fā)展。重組DNA技術(shù)開(kāi)辟了一條解決問(wèn)題的新途徑。常用的抗細(xì)菌基因有：殺菌肽、溶菌酶。

1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide563.抗真菌基因工程

基于對(duì)植物防御機(jī)制的初步了解，目前提出了以下基因工程抗真菌病害的技術(shù)路線：

幾丁質(zhì)酶與β-1,3-葡聚糖酶

過(guò)氧化酶

防御素

植物本身抗病基因和病原菌無(wú)毒基因

阻礙真菌蛋白質(zhì)合成的抗真菌蛋白，核糖體失活蛋白（RIP）

滲透蛋白基因（osmotin）抗毒素（phytoalexin）、植保素等。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide57（四）抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)作物大田里，雜草的存在可使農(nóng)作物減產(chǎn)10%。目前使用的除草劑專一性不強(qiáng)，或多或少對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)有影響，這就限制了除草劑的大量使用?，F(xiàn)有三種戰(zhàn)略構(gòu)建抗除草劑的農(nóng)作物：

I強(qiáng)化表達(dá)除草劑的靶蛋白（酶）基因：

目前使用的大量這類的除草劑中，只有少數(shù)幾種除草劑的細(xì)胞靶部位被鑒定。5-烯醇式為酸基莽草酸－3－磷酸鹽合成酶（EPSPS），是植物葉綠體中芳香族必需氨基酸生物合成中的一個(gè)酶，而除草劑草甘磷glyphosate（glifoseit）是通過(guò)強(qiáng)烈抑制該酶而殺死植物的。glyphosate在除草劑中使用最為廣泛。因?yàn)樗苌俚膭┝烤湍軞鐝V譜雜草，對(duì)環(huán)境的危害也比其它除草劑小，進(jìn)入土壤后能被微生物迅速降解。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide58將來(lái)自矮牽?；ǖ腅PSPScDNA轉(zhuǎn)入植物中，轉(zhuǎn)基因酶活比非轉(zhuǎn)基因植物提高了20倍，使得轉(zhuǎn)基因植物較好地耐受glyphosate的存在。但轉(zhuǎn)基因植物生長(zhǎng)緩慢。

II克隆表達(dá)除草劑的突變靶蛋白（酶）基因：

Klebsiellapneumoniae中的EPSPS對(duì)草甘磷親和性降低了16倍

鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌(Salmonellatyphimurium)分離出了一個(gè)EPSPS突變體，轉(zhuǎn)入煙草，表現(xiàn)出了較好的耐性。Monsanto公司的Kishore在E.coli分離出了一個(gè)突變體SM-1，對(duì)草甘磷的耐性提高了8000倍。

III除草劑的降解、解毒基因

溴腈衍生物（Bromoxynil）是一種抑制光合成反應(yīng)的除草劑，Klebsiellaozaenae有一基因編碼一種腈水解酶，能將Bromoxynil降解為3,5－二溴－4羥－苯甲酸。將該細(xì)菌基因轉(zhuǎn)入煙草中已獲成功。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide59（五）改變花型及花色的轉(zhuǎn)基因植物全世界花卉產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值高達(dá)上百億美元，通過(guò)插花工藝來(lái)裝飾花束和花籃，需要培育各種花卉植物。目前構(gòu)建具有不同花型及花色特征的轉(zhuǎn)基因花已成可能。有關(guān)研究工作主要集中在世界最大的花卉出口國(guó)荷蘭。

花冠的顏色是由花冠中的色素組成決定的。在大多數(shù)花卉中，色素為黃酮類物質(zhì)。它由苯丙氨酸通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)生成。而顏色主要取決于黃酮類似物質(zhì)側(cè)鏈取代基的不同性質(zhì)及結(jié)構(gòu)。比如花青素衍生物呈藍(lán)色。

在黃酮類色素物質(zhì)的生物合成途徑中，苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一個(gè)關(guān)鍵酶。

在矮牽牛屬植物中已成功地應(yīng)用反義RNA技術(shù)抑制1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide60了CHS基因的表達(dá)，使得在轉(zhuǎn)基因植物中花冠的顏色從野生型的紫紅色轉(zhuǎn)變成了白色。并且因?qū)HS基因表達(dá)的抑制程度差異而出現(xiàn)了一系列中間類型的花色。在煙草中，反義RNA抑制CHS基因表達(dá)，使野生型的桃紅色轉(zhuǎn)變成了白色花冠。

天然的玫瑰沒(méi)有藍(lán)色的花冠，因?yàn)樗N薇科植物缺少合成藍(lán)色色素的酶系，從矮牽牛花中克隆了一個(gè)控制合成藍(lán)色素的基因。目前正在將該基因轉(zhuǎn)入玫瑰植物中，期望出藍(lán)色的玫瑰。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide61（六）抗環(huán)境壓力的轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境大氣層中的氧自由基（超氧化物負(fù)離子）對(duì)植物的損傷是嚴(yán)重的。在生理狀況下，植物體內(nèi)的超氧化歧化酶（SOD）將之轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，后者經(jīng)過(guò)氧化酯作用后，分解釋放出水和氧氣。但過(guò)量的氧自由基則對(duì)植物的某些組織如花卉的壽命有所影響。將SOD基因轉(zhuǎn)入花卉植物中，可以節(jié)省氧氣的需求量，以增加鮮花的保存期。

另外，抗鹽、抗堿、抗寒、抗旱抗熱的轉(zhuǎn)基因植物也在研究中。常用的抗逆基因主要有以下幾種：抗凍蛋白（antifreezeprotein,AFP）

脯氨酸合成酶

甜菜堿合成酶

滲調(diào)蛋白（osmotin,OSM）

乙醇脫氫酶1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide62（七）改良作物的品質(zhì)傳統(tǒng)的植物育種以及雜交回交技術(shù)在過(guò)去一段時(shí)間內(nèi)培育出許多農(nóng)作物優(yōu)良品種，但這種技術(shù)已接近極限，植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有望打破這種限制：

1.植物淀粉合成的控制：

淀粉由直鏈淀粉與支鏈淀粉組成，淀粉的質(zhì)量與淀粉的組成有關(guān)。植物淀粉合成中的兩個(gè)重要的酶是淀粉合成酶（GBSS）以及分支酶（BE）。分別控制直鏈淀粉與支鏈淀粉的合成。淀粉的應(yīng)用領(lǐng)域包括食品、化學(xué)、造紙和紡織工業(yè)。不同的用途對(duì)淀粉的性質(zhì)有不同的要求。工業(yè)上一般要求淀粉中直鏈淀粉的量要盡可能少。進(jìn)入九十年代，人們已將內(nèi)衣和外源GBSS的反義基因成功地導(dǎo)入馬鈴薯中，使其GBSS活性降低了70%~100%。完全的抑制可得到不含直鏈的淀粉，但淀粉的總量不變。另外，導(dǎo)入EB的反義基因，也可得到無(wú)支鏈的淀粉。1/14/20244:40PM歡迎02級(jí)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)班同學(xué)們聽(tīng)課！Slide63

2.油科植物中脂肪酸合成的控制

植物油的組分大都是含有雙鏈的不飽和脂肪酸，故在室溫下多呈液態(tài)。人造黃油的工藝是將植物油催化加氫，使其熔點(diǎn)升高，加工成本很高，并且會(huì)導(dǎo)致順式雙鏈變成對(duì)健康不利的反式雙鏈。將植物內(nèi)控制脫飽和反應(yīng)的硬脂酰－ACP脫飽和酶基因的反義基因?qū)胫参镏?，即可有效地提高飽和脂肪酸的含量?/p>

3.植物種子儲(chǔ)存蛋白合成的控制

一般的農(nóng)作物糧食種子儲(chǔ)存蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值因缺少幾種氨基酸而受到限制（Lys、Met），人們將蠶豆中的一種廣譜蛋白基因植入玉米中，獲得了高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。下一進(jìn)是進(jìn)行土豆及水稻的改良。

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