DB14∕T 1789-2019 禽流感病毒H7亞型抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法

11.220B

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14/

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1789—2019禽流感病毒

H7

亞型抗體競(jìng)爭(zhēng)

ELISA檢測(cè)方法

發(fā)布

實(shí)施山西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB14/

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1789—2019 前言

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II1

范圍

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12

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13 實(shí)驗(yàn)原理

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14 實(shí)驗(yàn)條件

..........................................................................

15 實(shí)驗(yàn)方法

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16 結(jié)果判定

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27 注意事項(xiàng)

..........................................................................

3附錄

A（規(guī)范性附錄） 試劑配制方法....................................................

4DB14/

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1789—2019 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T

給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山西省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、武漢科前生物股份有限公司、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)。蘆俊彥、樊慧錦、寧艷、雷沖、王錦、劉田勇。IIDB14/

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1789—2019禽流感病毒

H7

1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中禽流感病毒H7亞型抗體方法的縮略語(yǔ)、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定和注意事項(xiàng)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽流感病毒亞型抗體的檢測(cè)。2 縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme

immunosorbent

assay）OD：光密度值(optical

HRP：辣根過(guò)氧化物酶(horseradish

3 實(shí)驗(yàn)原理亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原吸附到固相載體的表面，將待檢血清和特異性酶標(biāo)單抗同時(shí)加入包被板酶標(biāo)單抗就越少，陽(yáng)性血清反應(yīng)呈色淺于陰性血清。4 實(shí)驗(yàn)條件4.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境實(shí)驗(yàn)操作在15

℃～

℃下進(jìn)行。未滅活的感染性材料的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，應(yīng)在Ⅱ級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。4.2 儀器Ⅱ級(jí)生物安全柜、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)（或手洗）、微量移液器、冰箱、恒溫箱。5 實(shí)驗(yàn)方法5.1 實(shí)驗(yàn)材料禽流感病毒H7亞型包被抗原、HRP標(biāo)記的禽流感病毒H7亞型蛋白的單克隆抗體（酶標(biāo)記物）、底物液、終止液、樣品稀釋液、洗滌液、包被液、封閉液。試劑配制方法見(jiàn)附錄A。5.2 樣品準(zhǔn)備DB14/

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1789—2019取動(dòng)物全血，待血液充分凝固后，4

r/min離心10

min，收集血清。也可等凝固后自然析出血清。血清應(yīng)清亮，無(wú)溶血。樣品處理過(guò)程中應(yīng)防止樣品的污染，注意個(gè)人安全防護(hù)。5.3 包被用包被液將包被抗原稀釋至工作濃度2

μg/mL

μL2

℃～8℃條件下，包被15

h。5.4 封閉

μL

℃±1

℃孵育2

h37

℃±1

℃干燥2

h。5.5 待檢血清的稀釋待檢血清在血清稀釋板中做10倍稀釋。5.6 操作步驟5.6.1加樣取抗原包被板，先用洗滌液洗滌抗原包被板1次，稀釋好的待檢血清、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各取μL，加至抗原包被板中，每板待檢血清設(shè)1孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)2孔，同時(shí)加入酶標(biāo)記物

μL。輕輕振勻孔中樣品，置37

℃±1

℃下溫育45

min。5.6.2 洗滌棄去孔中液體，每孔加入洗滌液200μL5次，最后一次拍干。5.6.3 加酶標(biāo)抗體將辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體用封閉液稀釋?zhuān)靠准?00

μL，

℃±1

℃放置min。5.6.4 洗滌棄去孔中液體，每孔加入洗滌液200μL5次，最后一次拍干。5.6.5加底物液每個(gè)反應(yīng)孔加入底物液μL，置20

℃～25

℃下避光顯色15

。5.6.6 加終止液每孔加終止液50μL，10

內(nèi)在酶標(biāo)儀上測(cè)定450

波長(zhǎng)處的值。6結(jié)果判定試驗(yàn)成立的條件：陰性對(duì)照的平均OD450nm1.0，陽(yáng)性對(duì)照的抑制率（PI值）大于。S=樣品孔OD450nm值，N=陰性對(duì)照孔平均OD450nm值。PI值=(1-S/N)×100%。DB14/

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1789—2019若被檢樣品的抑制率小于，該樣品判為禽流感病毒H7亞型抗體陰性。若被檢樣品的抑制率大于或等于40%，該樣品判為禽流感病毒H7亞型抗體陽(yáng)性。7 注意事項(xiàng)7.1 人員防護(hù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意做好個(gè)人的安全防護(hù)工作。7.2 樣品處理血清應(yīng)在Ⅱ級(jí)生物安全柜中析出。7.3 廢棄物處理操作區(qū)應(yīng)有專(zhuān)門(mén)的固體和液體廢棄物收集容器。廢棄物經(jīng)高壓滅菌后按相關(guān)規(guī)定處理。DB14/

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1789—2019AA附

錄 A（規(guī)范性附錄）試劑配制方法A.1 包被液包被液為碳酸鹽緩沖液（0.025

mol/L，pH

）。將下列試劑按序加入1

mL規(guī)格的容器中，加800

mL蒸餾水充分溶解，定容至1

000

mL。碳酸鈉（Na2CO3） 1.59

g碳酸氫鈉（NaHCO3） 2.93

g加蒸餾水至 1

000

mLA.2 洗滌液氯化鈉（NaCl）

g氯化鉀（）

g十二水磷酸氫二鈉（Na24?12H2O） 2.9

g磷酸二氫鉀（KH2PO4）

gTween-20

加蒸餾水至 1

000

mLA.3 底物液商品化TMB顯色液。A.4 終止液98%濃硫酸（H24） 108.8

mL加蒸餾水至 1

000

mLA.5 樣品稀釋液氯化鈉（NaCl） 8.0

g氯化鉀（） 0.2

g十二水磷酸氫二鈉（Na24?12H2O） 2.9

g磷酸二氫鉀（KH2PO4） 0.2

g加蒸餾水至 1

mLA.6 封閉液牛血清白蛋白（BSA）