分子生物學(xué)實驗一、二報告

分子生物學(xué)實驗一、二重組DNA的制備、提取與酶切鑒定實驗原理1、CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞：感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)。細(xì)菌處于0℃的CaCl2低滲溶液中，會膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)過42℃短時間的熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富的培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)化子。pBR322質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因此接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉素的特性。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞在含Amp的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗Amp的能力而死亡，轉(zhuǎn)化體因含有pBR322質(zhì)粒而有抗Amp特性，從而可以正常生長。2、堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA：堿裂解法是利用線性大分子染色體DNA與小分子環(huán)形質(zhì)粒DNA的變性復(fù)性的差異從而進(jìn)行分離，在pH12.0～12.6的堿性環(huán)境中，線型染色體DNA和環(huán)型質(zhì)粒DNA氫鍵會發(fā)生斷裂，雙鏈解開而變性，但質(zhì)粒DNA由于其閉合環(huán)型結(jié)構(gòu)，氫鍵僅發(fā)生部分?jǐn)嗔?，而且其互補(bǔ)鏈不完全分離；當(dāng)將pH值調(diào)節(jié)到中性并在高鹽濃度下，已分開的染色體DNA互補(bǔ)鏈不能復(fù)性而交聯(lián)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，大部分染色體DNA、不穩(wěn)定的大分子RNA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，而部分變性的閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA在中性條件下很快復(fù)性，恢復(fù)到原來的構(gòu)型，呈可溶性狀態(tài)保存與溶液中，離心后上清中便含有所需要的質(zhì)粒DNA。繼續(xù)利用試劑盒（柱法）提純質(zhì)粒DNA。3、限制性內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。剪切后的核酸末端分粘性末端與平端。根據(jù)實驗需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，可以達(dá)到想要的片段從而進(jìn)行下一步有目的性的DNA重組。4、瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質(zhì)(密度與瓊脂糖濃度相關(guān))；而生理條件下，核酸分子的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)帶負(fù)電荷，因此將核酸分子置于電場中時，它們會向正極遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)象。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快。從而在控制影響DNA遷移速率的其他條件下，DNA遷移速率的快慢取決于DNA的bp多少。瓊脂糖凝膠電泳可以觀察DNA片段大小，分解情況，有無RNA污染等等，是質(zhì)控的重要環(huán)節(jié)。實驗步驟1.目的基因c-myc與pBR322質(zhì)粒載體的連接(粘端)2012.9.13目的基因片段（1.4kb），20ng/μl 2.5μl載體DNA（4.3kb），20ng/μl2.5μl10×buffer1μlT4DNA連接酶（10U/μl)0.5μlddH2O3.5μl總體積10ul混勻，短暫離心，16℃水浴中溫育2~4小時，4℃保存?zhèn)溆谩?.CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞取0.1ml大腸桿菌HB101培養(yǎng)物，加至5mlLB培養(yǎng)液中，37℃振搖約2h，細(xì)菌長至云霧狀，倒入15ml經(jīng)冰預(yù)冷的離心管，冰浴10min；4℃，4000rpm，離心10min，棄上清，在紙巾上倒置，控干液體，沉淀重懸于冰預(yù)冷的1ml，0.1mol/LCaCl2，吹打混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，冰浴10min；4℃，4000rpm，離心10min，棄上清，控干液體，重懸于200μl0.1mol/LCaCl2分裝成50μl/管，共2管。3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞1μl連接產(chǎn)物或陽性對照加入50μl感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42℃水浴90sec，立即冰浴1~2min，分別加入LB培養(yǎng)液150μl，37℃振搖45min，分別取100μl鋪板于含Amp的LB平板，37℃溫箱培養(yǎng)過夜。4.挑克隆2012.9.19在50ml離心管中加入10ml含有60μm/mlAmp的LB培養(yǎng)液，從實驗組平板上挑取含有希望得到的含有重組DNA的單菌落接種其中，37℃培養(yǎng)過夜。5.質(zhì)粒DNA的小量快速制備（試劑盒）2012.9.20將細(xì)菌培養(yǎng)物全部倒入15ml離心管，4500rpm，5min，棄上清，瀝干。加250μlBufferS1，吹打混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加250μlBufferS2，上下顛倒，溫和混勻4~6次使菌體裂解，加350μlBufferS3，上下顛倒，溫和混勻6~8次，12000g離心10min，吸取上清至已置于2ml離心管的制備管中，12000g離心1min，棄濾液，在制備管中加500μlBufferW1，12000g離心1min，棄濾液，在制備管中加700μlBufferW2，12000g離心1min，棄濾液，重復(fù)以BufferW2洗滌、離心一次，再空離心1次。將制備管移入新的1.5ml離心管，在膜中央加60μlEluent或去離子水，室溫靜置1min，12000g離心1min，即為質(zhì)粒DNA。6.質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶的雙酶切Buffer42μlEcoRⅠ(16U/μl)1μlClaⅠ(10U/μl)1μlddH2O6μl質(zhì)粒DNA10μl加入1.5ml離心管混勻后短暫離心，37℃水浴1小時7.制膠配制60ml1%Agarose溶液，加熱溶解，稍冷后加入6μlGelred，混勻后澆板，待凝。凝固后拔去梳子，小心取出，放入加油1*TAE溶液的電泳槽，補(bǔ)充加入1×TAE溶液，待液面稍高出凝膠時止。8.電泳上樣：未酶解質(zhì)粒10μl+2μl凝膠加樣緩沖液，雙酶切產(chǎn)物20μl+4μl凝膠加樣緩沖液，DNALadderMarker上樣5μl。連通電源，120V電泳至溴酚藍(lán)帶達(dá)到凝膠約1/2處。實驗結(jié)果1.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（圖1）圖1.大腸桿菌在含有氨芐青霉素（60μg/ml）的LB培養(yǎng)平板上的生長情況（左側(cè)：對照組，右側(cè)：實驗組）2.質(zhì)粒酶切后電泳（圖2）圖2.酶切質(zhì)粒與未酶切質(zhì)粒的電泳結(jié)果。從左至右為DNALadderMarker，雙酶切質(zhì)粒DNA（2條區(qū)帶），未酶切質(zhì)粒DNA（3條區(qū)帶）。討論1.影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素（1）感受態(tài)細(xì)菌的效價：應(yīng)注意細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞，密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。（2）轉(zhuǎn)化的條件：新制備的感受態(tài)細(xì)胞，可立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化；若在低溫條件下放置，轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24小時達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降。（3）質(zhì)粒DNA與受體菌的比例：一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比（4）操作：所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行，所使用的器皿必須干凈；懸浮細(xì)胞時要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉(zhuǎn)化。2.質(zhì)粒酶切后電