酶制劑質(zhì)量要求 第4部分：固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑 征求意見稿

GB/T23527.4—XXXX酶制劑質(zhì)量要求第4部分：固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑本本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑的術(shù)語和定義、要求、試驗方法、檢驗規(guī)則和標(biāo)志、包裝、運輸、貯存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑的生產(chǎn)、檢驗和銷售。2規(guī)范性引用文件下列文件的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期的對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運圖示標(biāo)志GB/T601化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備GB/T602化學(xué)試劑雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1葡萄糖異構(gòu)酶glucoseisomerase以淀粉質(zhì)（或糖質(zhì)）為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵、提純等工藝制得，能將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的酶。3.2固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑immobilizedglucoseisomerasepreparations經(jīng)載體固定化而成的葡萄糖異構(gòu)酶制劑。3.3葡萄糖異構(gòu)酶活力activityofglucoseisomerase葡萄糖異構(gòu)酶活力以葡萄糖異構(gòu)酶活力單位表示，定義為1g固體化葡萄糖異構(gòu)酶，在本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的反應(yīng)條件下，1h轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1mg果糖，即為1個酶活力單位，以u/g表示。3.4生產(chǎn)能力productivity在適宜的工作條件下，酶活力降至原活力的10%的過程中，1kg固定化酶能轉(zhuǎn)化絕干葡萄糖為絕干果葡糖的量。4要求4.1感官GB/T23527.4—XXXX不結(jié)塊，無異味。4.2固定化載體所使用的固定化載體需符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。4.3理化要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑的理化要求項目要求葡萄糖異構(gòu)酶活力a，u/g≥2000生產(chǎn)能力，t/kg≥5強度合格干燥失重/%≤8.0a可按供需雙方合同規(guī)定的葡萄糖異構(gòu)酶活力規(guī)格執(zhí)行。5試驗方法5.1一般要求本方法中所用的水，在未注明其他要求時，應(yīng)符合GB/T6682-2008中水的規(guī)格，所用試劑，在未注明其他規(guī)格時，均指分析純。分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑及制品，在沒有注明其他要求時，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備。5.2感官要求稱取樣品10g（或10mL），觀察、嗅聞作出判斷，做好記錄。5.3葡萄糖異構(gòu)酶活力5.3.1適用于鏈霉菌（Streptomycessp.）生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶制劑5.3.1.1溶液和試劑5.3.1.1.1葡萄糖溶液（700g/L）稱取70g葡萄糖加入沸水中，使其完全溶解，冷卻后用蒸鎦水定容至100mL。5.3.1.1.2磷酸緩沖溶液（pH=7.5）稱取磷酸二氫鈉1.96g和十二水合磷酸氫二鈉39.62g，用水溶解并定容到500mL，調(diào)節(jié)溶液pH至7.5±0.05。5.3.1.1.3硫酸鎂溶液（61g/L）稱取12.3g七水合硫酸鎂，加水溶解并定容至100mL。5.3.1.1.4高氯酸溶液（210mL/L）量取市售的高氯酸試劑21mL，用水定容至500mL。5.3.1.2分析步驟GB/T23527.4—XXXX稱取適量固定化酶完整顆粒，用1mL磷酸緩沖溶液（5.3.1.1.2）于3℃~7℃浸泡16h后，加1.5mL磷酸緩沖溶液（5.3.1.1.20.5mL硫酸鎂溶液（5.3.1.1.3）和1.5mL葡萄糖溶液（5.3.1.1.1再加水調(diào)整至總體積5mL，在70℃水浴中反應(yīng)1h，加入5mL高氯酸溶液（5.3.1.1.4）終止反應(yīng)。5.3.2適用于游動放線菌（Actinoplanessp.）生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶制劑5.3.2.1溶液和試劑5.3.2.1.1葡萄糖溶液（540g/L）稱取54.0g無水葡萄糖加入沸水中，使其完全溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100mL。5.3.2.1.2磷酸緩沖溶液（pH=7.0）稱取磷酸氫二鈉12.36g和十二水合磷酸二氫鈉41.0g，加水溶解并定容至1000mL，調(diào)節(jié)溶液pH至7.0±0.05。5.3.2.1.3硫酸鎂溶液（3.66g/L）稱取0.739g七水合硫酸鎂，加水溶解并定容至100mL。5.3.2.1.4硫酸鈷溶液（0.46g/L）稱取0.0843g七水合硫酸鈷，加水溶解并定容至100mL。5.3.2.2分析步驟稱取適量固定化酶完整顆粒，用1mL磷酸緩沖溶液（5.3.2.1.2）于3℃~7℃浸泡16h后，加0.5mL磷酸緩沖溶液（5.3.2.1.20.5mL硫酸鎂溶液（5.3.2.1.30.5mL硫酸鈷溶液（5.3.2.1.4）和2.5mL葡萄糖溶液（5.3.2.1.1），再加水調(diào)整至總體積5mL，在70℃水浴中反應(yīng)1h，加入5mL髙氯酸溶液（5.3.1.1.4）終止反應(yīng)。5.3.3果糖的測定5.3.3.1溶液和試劑5.3.3.1.1半胱氨酸鹽酸鹽溶液（15g/L）稱取半胱氨酸鹽酸鹽0.375g，用水溶解定容至25mL。5.3.3.1.2咔唑酒精溶液（1.2g/L）稱取咔唑30.0mg，用無水酒精溶解定容至25mL，放置在棕色瓶中，24h后使用。5.3.3.1.3硫酸溶液取市售濃硫酸450mL，在不斷攪拌下緩慢倒入190mL水中。5.3.3.1.4標(biāo)準(zhǔn)果糖溶液稱取55℃真空干燥至恒重的果糖125.0mg（精確至0.0001g），用水定容至25mL，存放于冰箱備用，使用時稀釋100倍。5.3.3.2分析步驟5.3.3.2.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取25mL比色管分別加入50μg/mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL和0.8mL，分別用蒸餾水補充至1mL后，于每管中加入0.2mL半胱氨酸鹽酸鹽溶液（5.3.3.1.1）、6mL硫酸溶液（5.3.3.1.3搖勻后，立即加入0.2mL咔唑酒精溶液（5.3.3.1.2搖勻，于60℃水浴中保溫10min，取出，用水冷卻，用10mm比色皿于560nm波長下比色，以吸光度對果糖作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.3.3.2.2樣品測定GB/T23527.4—XXXX將5.3.1.2或5.3.2.2的反應(yīng)終止液適當(dāng)稀釋后（使果糖含量在20~30μg/mL范圍內(nèi)），準(zhǔn)確吸取1.0mL于25mL比色管，加入0.2mL半胱氨酸鹽酸鹽溶液（5.3.3.1.1）、6mL硫酸溶液（5.3.3.1.3），搖勻后，立即加入0.2mL咔唑酒精溶液（5.3.3.1.2搖勻，于60℃水浴中保溫10min，取出，用水冷卻，用10mm比色皿于560nm波長下比色，記錄吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查得相應(yīng)的果糖含量。5.3.4計算5.3.4.1酶反應(yīng)液產(chǎn)生果糖含量的計算酶反應(yīng)液產(chǎn)生果糖的含量按式（1）計算： 式中：X1——酶反應(yīng)液產(chǎn)生果糖的質(zhì)量，單位為克（g）；m1——吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的果糖質(zhì)量，單位為微克(μg）；n——稀釋倍數(shù)；1000——質(zhì)量換算系數(shù)。結(jié)果保留至整數(shù)位5.3.4.2樣品酶活力的計算樣品的酶活力按式（2）計算：式中：X2——樣品的酶活力，u/g；U——酶活力單位，u；m2——樣品質(zhì)量，單位為克（g）。5.3.5精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值應(yīng)不超過算術(shù)平均值的2%。5.4生產(chǎn)能力生產(chǎn)能力按式（3）計算：Sm31000Sm31000式中：X3——生產(chǎn)能力，單位為噸每千克（t/kg）；∑S——轉(zhuǎn)化糖量的總和，單位為千克（kg）；m3——轉(zhuǎn)化時所用固定化酶的量，單位為千克（kg）；果葡糖中果糖含量按42%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）計。5.5強度固定化酶用60℃蒸餾水浸沒，緩慢攪動20h，用兩個手指用力擠壓，放開后不成漿（或極少量成漿）仍硬，為合格。否則為不合格。5.6干燥失重GB/T23527.4—XXXX5.6.1儀器5.6.1.1電熱干燥箱。5.6.1.2分析天平：精度為0.000lg。5.6.1.3稱量瓶：50mm×30mm。5.6.2分析步驟用烘干至恒重的稱量瓶稱取酶樣約2g，精確至0.0001g，置于103℃±2℃電熱干燥箱中將蓋取下，側(cè)放在稱量瓶旁，烘干2h，取出，加蓋，放入干燥器中冷卻至室溫，稱量。5.6.3計算干燥失重按照式（4）計算：式中：X4——生產(chǎn)能力，單位為噸每千克（t/kg）；m4——稱量瓶的質(zhì)量，單位為克（g）；m5——干燥前稱量瓶加樣品的質(zhì)量，單位為克（g）；m6——干燥后稱量瓶加樣品的質(zhì)量，單位為克（g）。所得結(jié)果保留至一位小數(shù)。6檢驗規(guī)則6.1批次同原料、同配方、同工藝、同生產(chǎn)線連續(xù)生產(chǎn)的產(chǎn)品為一批。6.2取樣規(guī)則和樣本量6.2.1成品抽樣的樣本量見表2。取樣的樣本量可按照估計的批量參照表2執(zhí)行，或由生產(chǎn)企業(yè)和（或）相關(guān)方確定。批取樣量不得少于300mL（或300g），不足者應(yīng)按比例適當(dāng)加取。表2成品抽樣的樣本量批量范圍/最小外包裝單位抽樣的樣本量/最小外包裝單位251~5003>5004注：批量是指批中所包含的單位商品數(shù)，樣本量是指樣本中所包含的樣本單位數(shù)。6.2.2取樣應(yīng)均勻分布在整個灌裝過程中，或均勻分布于灌裝后的成品中。6.2.3取樣時應(yīng)采用適宜的方法保證取樣具有代表性，保證取樣部位和取樣瓶的清潔。6.3檢驗分類6.3.1出廠檢驗6.3.1.1產(chǎn)品出廠前，應(yīng)由生產(chǎn)廠的質(zhì)檢部門按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定逐批進行檢驗，檢驗合格，并附上質(zhì)量合格證明的，方可出廠。6.3.1.2檢驗項目：感官、酶活力、干燥失重。GB/T23527.4—XXXX6.3.2型式檢驗6.3.2.1檢驗項目：本標(biāo)準(zhǔn)中全部要求項目。6.3.3一般情況下，同一類產(chǎn)品的型式檢驗每半年至少進行一次，有下列情況之一者，亦應(yīng)進行：a）原輔材料有較大變化時；b）更改關(guān)鍵工藝或設(shè)備；c）新試制的產(chǎn)品或正常生產(chǎn)的產(chǎn)品停產(chǎn)3個月后，重新恢復(fù)生產(chǎn)時；d）出廠檢驗與上次型式檢驗結(jié)果有較大差異時；e）國家監(jiān)督機構(gòu)按有關(guān)規(guī)定需要抽檢時。6.4判定規(guī)則6.4.1出廠檢驗和（或）型式檢驗合格時，由質(zhì)檢部門出具產(chǎn)品合格證。6.4.2出廠檢驗和（或）型式檢驗不合格時，在原批次基礎(chǔ)上加倍取樣，對不合格項目進行復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果只要有一項不合格，判該批產(chǎn)品為不合格。7標(biāo)志、包裝、運輸及貯存7.1標(biāo)志7.1.1產(chǎn)品的外包裝宜使用符合GB/T191要求的標(biāo)志。7.1.2產(chǎn)品的包裝上應(yīng)貼有牢固的標(biāo)簽。標(biāo)志內(nèi)容應(yīng)包括品名、產(chǎn)地、廠名、規(guī)格（葡萄糖異構(gòu)酶酶活力等）、生產(chǎn)日期、批號或代號、保質(zhì)期等。7.2包裝產(chǎn)品的內(nèi)包裝和（或）包裝容器的內(nèi)涂料應(yīng)采用國家批準(zhǔn)的材料，食品工業(yè)用產(chǎn)品應(yīng)符合相應(yīng)的食品包裝用/食品容器衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的材料。7.3運輸產(chǎn)品在運輸過程中應(yīng)輕拿輕放，嚴(yán)防雨淋和曝曬。運輸工具應(yīng)清潔、無毒、無污染。嚴(yán)禁與有毒、有害、有腐蝕性的物質(zhì)混裝混運。7.4貯存產(chǎn)品應(yīng)貯存在陰涼干燥的環(huán)境下。嚴(yán)禁與有毒、有害、有腐蝕性的物質(zhì)同存。GB/T23527.4—XXXX附錄A（資料性）固定化葡萄糖異構(gòu)酶活力的測定A.1范圍本方法適用于測定固定化葡萄糖異構(gòu)酶樣品的活力。A.2原理和反應(yīng)條件A.2.1原理利用葡萄糖異構(gòu)酶可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的原理，把酶裝填在柱子中并在標(biāo)準(zhǔn)條件下與葡萄糖漿反應(yīng)。用旋光儀檢測由葡萄糖轉(zhuǎn)化來的果糖，從轉(zhuǎn)化速率計算酶的活力。A.2.2反應(yīng)條件葡萄糖：450g/kg。底物：pH=7.5。溫度：60℃。Mg2+：99mg/L（1.0g/L七水合硫酸鎂）。Ca2+：<2μg/g。激活因子，SO2：100μg/g（0.18g/L焦亞硫酸鈉）。轉(zhuǎn)化率：0.40~0.45。碳酸鈉緩沖液：2mmol/L。A.3縮略語下列縮略語適用于本附錄IGIU；immobilizedglucoseisomeraseunits，葡萄糖異構(gòu)酶的活力單位。A.4專一性和靈敏度本方法的定量限為160IGIU/g。注：IGIU表示在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol葡萄糖所需的酶量。A.5儀器和設(shè)備A.5.1恒溫水?。壕取?.2℃。A.5.22.5cm×20cm玻璃柱。A.5.3變速蠕動泵。A.5.4折光儀。A.5.5自動進樣器A.6試劑本方法中所用的水，在未注明其他要求時，應(yīng)符合GB/T6682-2008中水的規(guī)格，所用試劑，在未注明其他規(guī)格時，均指分析純。分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑及制品，在沒有注明其他要求時，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備A.6.1硫酸鎂儲備液（226g/L）稱取七水合硫酸鎂463.0g，用水溶解并定容到1000mL。GB/T23527.4—XXXXA.6.2硫酸鎂工作液（0.226g/L）取上述溶液1.0mL，用水定容到1000mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。A.6.3氫氧化鈉溶液1（40g/L）取氫氧化鈉40.0g，用水溶解并定容到1000mL。A.6.4氫氧化鈉溶液2（160g/L）取氫氧化鈉160.0g，用水溶解并定容到1000mLA.6.5碳酸鈉溶液（105.99g/L）取碳酸鈉105.99g，用水溶解并定容到1000mL。A.6.6硫酸溶液取濃硫酸27.2mL，在攪拌條件下緩慢倒人一定量的水中，待冷卻到室溫后用水定容到1000mL。A.6.7葡萄糖底物（450g/kg，pH=7.5）分別稱取539.0g無水葡萄糖，1.0g七水合硫酸鎂、0.21g碳酸鈉和0.18g焦亞硫酸鈉，在加熱（最高70℃)和攪拌下完全溶于700mL去離子水中。冷卻到25℃,用0.5mol/硫酸溶液（A.6.6）調(diào)節(jié)pH到7.50士0.03，然后用去離子水定容至1000mL或定重到1199g。然后分別取87.0mL硫酸鎂儲備液（A.6.1），80.0mL碳酸鈉溶液（A.6.5），7.12g焦亞硫酸鈉和約28.5mL硫酸溶液（A.6.6）到上述定容的葡萄糖底物中，攪拌均勻。檢查溶液的pH，如需要，用氫氧化鈉溶液2（A.6.4）或硫酸溶液（A.6.6）調(diào)節(jié)到7.50±0.03。A.7標(biāo)準(zhǔn)對照品如可能，在每次試驗中應(yīng)加一個標(biāo)準(zhǔn)對照品，以檢查測定的穩(wěn)定性。如標(biāo)準(zhǔn)對照品的檢測值與標(biāo)志值超過精密度所規(guī)定的范圍，需要重新進行試驗。A.8試驗步驟分析試驗持續(xù)3天。其中第一天主要用來安裝設(shè)備和酶樣品的填柱處理，第二天用來進行預(yù)試驗，第三天用來正式測定樣品的活力。以下分別描述第一天、第二天和第三天的試驗步驟A.8.1第一天A.8.1.1準(zhǔn)備底物按照A.6.7所規(guī)定的方法準(zhǔn)備底物。A.8.1.2準(zhǔn)備水浴水浴鍋中加水直到足夠浸沒玻璃柱（A.5.2）。設(shè)定溫度到60℃。達到溫度后將空玻璃柱放入水浴中。A.8.1.3流速選擇和樣品量依據(jù)預(yù)期的樣品酶活力選擇樣品量和配套的流速（見表A.1）使用前樣品的預(yù)期活力先乘以0.7作校正。將管線接到變速蠕動泵和玻璃柱上。啟動泵使管路環(huán)線中充滿底物。表A.1樣品與流速的選擇估計活力/IGIU樣品質(zhì)量/g流速/（mL/min）550650064406GB/T23527.4—XXXX估計活力/IGIU樣品質(zhì)量/g流速/（mL/min）4207380735073208280825080.8022090.8090.6090.60A.8.1.4樣品溶脹稱取一定量的樣品到100mL燒杯中，加人約40mL底物，放置60min，前15min每5min攪拌一次，然后定時攪拌。A.8.1.5裝填柱子將溶脹的酶攪拌后注入玻璃柱中，燒杯中剩余的酶用硫酸鎂工作液（A.6.2）清洗注入柱中。待溶脹的酶沉降下來，將浸透1.88mmol/L的硫酸鎂工作液的棉塞（約0.69g~0.71g）推入柱中，距酶表面約1cm~2cm。盡量避免棉塞中有氣泡。待柱中充滿液體后將柱子蓋上，蓋子要固定在架子上。將架子架在水浴中，架子的兩翼要在水浴外。然后將泵管連在蓋子上，將出口連上出口管。檢查一下，保證所有出口都能滴液。接著將架子兩翼折好，架子放下深人到水浴中，蓋上水浴蓋。再檢查一下，保證所有出口都能滴液及所有出口管都連在出口上。如果出口管不滴液則有可能被堵寨。這種情況下檢查是否少量固定化酶堵塞了通路。如需要，可以采用反向通液的方法來嘗試解決。A.8.2第二天在第二天和第三天收集轉(zhuǎn)化產(chǎn)物時需保持反應(yīng)環(huán)境溫度的穩(wěn)定。由于水浴將散發(fā)出大量的熱，可以考慮采用使用空調(diào)的方法來調(diào)節(jié)環(huán)境溫度。第二天收集的第一個轉(zhuǎn)化產(chǎn)物作為葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖過程的參考品。這個對照品可以用來調(diào)節(jié)流速以保證第三天活力測定時轉(zhuǎn)化率在0.40~0.45之間。A.8.2.1pH調(diào)節(jié)檢查底物pH為7.50±0.03。讀取底物的折光值。如果底物的pH不是7.50±0.03，用硫酸溶液（A.6.6）或氫氧化鈉溶液1（A.6.3）調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH2h之內(nèi)不能取樣測定。如果pH在范圍之內(nèi)，收集轉(zhuǎn)化產(chǎn)物約10mL用于下一步測試。A.8.2.2測試向所有收集的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中加入0.1mL氫氧化鈉溶液1（A.6.4）以使變旋作用更快達到平衡。從完成收集轉(zhuǎn)化產(chǎn)物到完成測試應(yīng)在45min之內(nèi)，這是為了防止蒸發(fā)。收集的樣品用旋光數(shù)值測定轉(zhuǎn)化率。樣品可按下列順序測試：用水設(shè)零→2次底物→2次水→轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。重復(fù)操作直到完成所有分析。最后用2次水、2次乙醇和2次水清洗儀器GB/T23527.4—XXXX記錄樣品的折光值、