衛(wèi)生化學(xué)第四章-yxm

衛(wèi)生化學(xué)楊雪梅xujp@61648564第四章

紫外-可見分光光度分析法4.1紫外-可見分光光度法概述

4.2紫外-可見分光光度法的理論基礎(chǔ)4.3紫外-可見分光光度法的定量基礎(chǔ)——吸收定律

4.4紫外-可見分光光度計(jì)4.5分光光度測定方法4.6紫外-可見分光光度法的應(yīng)用基于物質(zhì)光化學(xué)性質(zhì)而建立起來的分析方法稱之為光化學(xué)分析法。分為:光譜分析法和非光譜分析法。光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通

過測量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長和強(qiáng)度來進(jìn)行分析的方法。4.1紫外-可見分光光度法概述紫外-可見分光光度法吸收光譜分子4.1紫外-可見分光光度法概述

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm，可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400760nm，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。4.2紫外-可見吸收光譜的理論基礎(chǔ)光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動(dòng)性可用波長

、頻率

、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來描述:

=c；波數(shù)=1/

=

/c粒子性則用能量描述,光是由光子流組成，光子的能量：

E=h=hc/

（Planck常數(shù)：h=6.626×10-34J·S)

光的波長越短（頻率越高），其能量越大。

物質(zhì)分子內(nèi)部三種運(yùn)動(dòng)形式：

（1）電子相對(duì)于原子核的運(yùn)動(dòng)（2）原子核在其平衡位置附近的相對(duì)振動(dòng)（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)分子具有三種不同能級(jí)：電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)三種能級(jí)都是量子化的，且各自具有相應(yīng)的能量分子的內(nèi)能：電子能量Ee

、振動(dòng)能量Ev

、轉(zhuǎn)動(dòng)能量Er

即E＝Ee+Ev+Er

ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜能級(jí)躍遷

紫外-可見光譜屬于電子躍遷光譜。

電子能級(jí)間躍遷的同時(shí)總伴隨有振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜吸收曲線（1）同一種物質(zhì)對(duì)不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長稱為最大吸收波長λmax（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變；

而對(duì)于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax都不同。（3）吸收光譜（吸收曲線）可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。1.電子能級(jí)和躍遷4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜

*躍遷

max<170nm，遠(yuǎn)紫外區(qū)或真空紫外區(qū)。飽和有機(jī)化合物的電子躍遷在遠(yuǎn)紫外區(qū)甲烷，

max=125nmn

*躍遷

max<250nm，遠(yuǎn)紫外區(qū)。電負(fù)性越小，波長越長。含未共享電子對(duì)的取代基可發(fā)生n

*躍遷S，N，O，Cl，Br，I等雜原子的飽和烴甲胺，

max=213nm4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜3)*躍遷一般在紫外區(qū)；雙鍵共軛，波長紅移，吸收增強(qiáng)；

max增加。紫外-可見吸收光譜主要研究共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜4)n*躍遷一般在近紫外區(qū);有時(shí)在可見區(qū);弱吸收帶

*躍遷幾率大，是強(qiáng)吸收帶；n

*躍遷幾率小，是弱吸收帶，許多化合物既有

電子又有n電子，既可發(fā)生

*又可n

*躍遷。-COOR：

*：

max=165nmn

*：

max=205nm4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜生色團(tuán)（和助色團(tuán)）是分子產(chǎn)生紫外-可見吸收的條件生色團(tuán)(chromophore)：能產(chǎn)生紫外-可見吸收的官能團(tuán)如一個(gè)或幾個(gè)不飽和鍵C=C,C=O,N=N,N=O等助色團(tuán)(auxochrome)：有一些含有n電子的基團(tuán)(如－OH、－OR、－NH２、－NHR、－X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當(dāng)它們與生色團(tuán)相連時(shí)，就會(huì)發(fā)生n—π共軛作用，增強(qiáng)生色團(tuán)的生色能力(吸收波長向長波方向移動(dòng)，且吸收強(qiáng)度增加)，這樣的基團(tuán)稱為助色團(tuán)。由于化合物結(jié)構(gòu)變化（共軛、引入助色團(tuán)取代基）或采用不同溶劑后

吸收峰位置向長波方向的移動(dòng)，叫紅移吸收峰位置向短波方向移動(dòng)，叫藍(lán)移增色效應(yīng)和減色效應(yīng)

增色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度增強(qiáng)的效應(yīng)減色效應(yīng)：吸收強(qiáng)度減小的效應(yīng)1．共軛效應(yīng)的影響(1)

電子共軛體系增大，

max紅移，

max增大(2)空間阻礙使共軛體系破壞，

max藍(lán)移，

max減小。4.2.1影響紫外-可見吸收光譜的因素給電子能力順序：-N(C2H5)2>-N(CH3)2>-NH2>-OCH3>-OH>-NHCOCH3>-OCOCH3>-CH2CH2COOH>-H4.2.1影響紫外-可見吸收光譜的因素2取代基的影響給電子基：含未共用電子對(duì)的原子的基團(tuán)。如-NH2,-OH等。吸電子基：易吸引電子而使電子容易流動(dòng)的基團(tuán)。如：-NO2,-CO等作用強(qiáng)度順序：-N+(CH3)3>-NO2>-SO3H>-COH>-COO->-COOH>-COOCH3>-Cl>-Br>-I給電子能力順序：-N(C2H5)2>-N(CH3)2>-NH2>-OCH3>-OH>-NHCOCH3>-OCOCH3>-CH2CH2COOH>-H4.2.1影響紫外-可見吸收光譜的因素2取代基的影響給電子基：含未共用電子對(duì)的原子的基團(tuán)。如-NH2,-OH等。吸電子基：易吸引電子而使電子容易流動(dòng)的基團(tuán)。如：-NO2,-CO等作用強(qiáng)度順序：-N+(CH3)3>-NO2>-SO3H>-COH>-COO->-COOH>-COOCH3>-Cl>-Br>-I4.2.1影響紫外-可見吸收光譜的因素給電子基未共用電子對(duì)流動(dòng)性大，形成p-

共軛，降低能量，

max紅移。吸電子基的存在產(chǎn)生

電子的永久性轉(zhuǎn)移，

max紅移。

電子流動(dòng)性增加，吸收光子的吸收分?jǐn)?shù)增加，吸收強(qiáng)度增加。給電子基與吸電子基同時(shí)存在，產(chǎn)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移吸收，

max紅移，

max增加。

4.2.1影響紫外-可見吸收光譜的因素3溶劑的影響4.2.1影響紫外-可見吸收光譜的因素溶劑極性增大

*躍遷波長紅移4.2.1影響紫外-可見吸收光譜的因素溶劑極性增大n*躍遷波長藍(lán)移水4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜吸收光譜的產(chǎn)生1分子含有生色團(tuán)和助色團(tuán)2吸收紫外可見光并伴隨電子能級(jí)躍遷3不同官能團(tuán)吸收不同波長的光作波長掃描記錄吸光度對(duì)波長的變化曲線得到該物質(zhì)的紫外-可見吸收光譜

電荷轉(zhuǎn)移吸收帶4.2分子結(jié)構(gòu)與吸收光譜電荷從給體（donor）向受體（acceptor）轉(zhuǎn)移：特點(diǎn)：吸收強(qiáng)度大

max>104

測定靈敏度高

4.3紫外-可見分光光度法的定量基礎(chǔ)——吸收定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)，1729年、1760年：光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系：A∝b

1852年，比爾(Beer)：光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系：A∝c

朗伯—比爾定律：在一定條件下，物質(zhì)的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。

4.3.1朗伯—比爾定律朗伯—比爾定律數(shù)學(xué)表達(dá)式c：溶液的濃度，單位g·L-１a：吸光系數(shù)，單位L·g-１·cm-１

a與ε的關(guān)系為：

a=ε/M

（M為摩爾質(zhì)量）

A：吸光度；描述溶液對(duì)光的吸收程度；

b：光程長度，單位cm；

c：溶液的量濃度，單位mol·L-１；ε：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol-１·cm-１；或:透光度(透光率)T透過度T:描述入射光透過溶液的程度:吸光度A與透光度T的關(guān)系:理解朗伯—比爾定律朗伯—比爾定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測量；摩爾吸光系數(shù)ε在數(shù)值上等于濃度為1mol·L-1、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度；吸光系數(shù)a(L·g-1·cm-1）相當(dāng)于濃度為1g·L-1、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度。摩爾吸光系數(shù)ε討論吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時(shí)，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；可作為定性鑒定的參數(shù)；同一吸收物質(zhì)在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數(shù)，以εmax表示。εmax表明了該物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。εmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。ε>105：超高靈敏；摩爾吸光系數(shù)ε討論ε=(6～10）×104

：高靈敏；ε<2×104

：低靈敏。4.3.2偏離比爾定律的因素

標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對(duì)朗伯—比爾定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：①物理性因素，即儀器的非理想引起的；②化學(xué)性因素。朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。難以獲得真正的純單色光。分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對(duì)朗伯—比耳定律的正或負(fù)偏離。非單色光、雜散光、非平行入射光都會(huì)引起對(duì)朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。①物理性因素

為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。②化學(xué)性因素

朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時(shí)才基本符合！

當(dāng)溶液濃度c>10－2mol/L時(shí)，吸光質(zhì)點(diǎn)間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對(duì)光的吸收。故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時(shí)。使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。溶液中CrＯ42-、Cr2Ｏ72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故：此時(shí)溶液pH對(duì)測定有重要影響。例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：CrＯ42-

＋2H＋

=Cr2Ｏ72-

＋H2Ｏ②化學(xué)性因素4.4紫外-可見分光光度計(jì)

可見分光光度計(jì)

紫外-可見分光光度計(jì)4.4.1分光光度計(jì)的主要部件光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源在整個(gè)紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。2.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出任一波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號(hào)變成可測的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)

檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理4.4.2分光光度計(jì)的類型1.單光束

簡單，價(jià)廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。自動(dòng)記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。2.雙光束3.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無需參比池,可消除吸收池不匹配或溶液基體差異造成的誤差。

4.5.1分析條件的選擇

1.溶劑的選擇

2.顯色反應(yīng)

3.顯色反應(yīng)條件的選擇

4.測量條件的選擇4.5.2定性定量分析

1.定性分析

2.定量分析4.5分光光度測定方法1.溶劑的選擇原則是：對(duì)樣品的溶解度要好，不干擾顯

色反應(yīng)；盡可能無吸收，若有吸

收，其吸收波長要小于待測組分

的吸收波長。

實(shí)驗(yàn)確定——選擇合適的溶劑，提高反

應(yīng)的靈敏度及加快反應(yīng)速度。4.5.1分析條件的選擇2.顯色反應(yīng)1）選擇顯色反應(yīng)時(shí)，應(yīng)考慮的因素①靈敏度高：尤其是對(duì)低含量組分，一般選擇：

ε＝104~105L/mol·cm

；②選擇性高：干擾少或易排除；

③顯色反應(yīng)定量進(jìn)行、有確定的化學(xué)計(jì)量關(guān)系、生

成物穩(wěn)定；④顯色劑在測定波長處無明顯吸收，兩種有色物最

大吸收波長之差：“對(duì)比度”，要求△

>60nm。2）配位顯色反應(yīng)

當(dāng)金屬離子與有機(jī)顯色劑形成配合物時(shí)，通常會(huì)發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移躍遷，產(chǎn)生很強(qiáng)的紫外—可見吸收光譜。例如：Fe3+與SCN-的反應(yīng)2.顯色反應(yīng)3）氧化還原顯色反應(yīng)

某些元素的氧化態(tài)，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見光區(qū)能強(qiáng)烈吸收，可利用氧化還原反應(yīng)對(duì)待測離子進(jìn)行顯色后測定。

例如：鋼中微量錳的測定，Mn2＋不能直接進(jìn)行光度測定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋

+10SO42-＋16H+

將Mn2＋氧化成紫紅色的MnO4＋后，525nm處進(jìn)行測定。2.顯色反應(yīng)4）顯色劑

無機(jī)顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。

有機(jī)顯色劑：種類繁多

偶氮類顯色劑：本身是有色物質(zhì)，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應(yīng)靈敏度高、選擇性好、對(duì)比度大等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。

三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等2.顯色反應(yīng)

作吸光度A與顯色劑用量CR的關(guān)系曲線，會(huì)出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦（或最高）處。1）顯色劑用量3.顯色反應(yīng)條件的選擇①對(duì)金屬離子存在狀態(tài)的影響——防止水

解，防止沉淀生成；②對(duì)顯色劑濃度的影響：改變存在形式；③對(duì)顯色劑顏色的影響：改變結(jié)構(gòu)

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對(duì)應(yīng)的pH范圍。3.顯色反應(yīng)條件的選擇2）反應(yīng)體系的酸度顯色時(shí)間：各種顯色反應(yīng)的速度不同，反應(yīng)完全所需時(shí)間不同；有些有色化合物在一定的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。

選擇方法：作A-t（min）曲線，選擇在A較大且穩(wěn)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。

顯色溫度：顯色反應(yīng)一般在室溫下進(jìn)行，但反應(yīng)速度太慢或常溫下不易進(jìn)行的顯色反應(yīng)需要升溫或降溫

選擇方法：作A-T（

C）曲線，選擇在A最大的溫度。

3.顯色反應(yīng)條件的選擇3）顯色時(shí)間與溫度4）共存離子干擾的消除選擇掩蔽劑的原則：掩蔽劑不與待測組分反應(yīng)；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應(yīng)產(chǎn)物不干擾待測組分的測定。例：測定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽劑使Fe3+(黃色)成為Fe(PO４)23-(無色)，消除Fe3+的干擾；①加入掩蔽劑Ag+：CN-、Cl-、Br-、I-、SCN-、S2O32-、NH3

；Al3+：EDTA、F-、OH-、檸檬酸、酒石酸、草酸、

乙酰丙酮、丙二酸；As3+：S2-、二巰基丙醇、二巰基丙磺酸鈉；Au+

：Cl-、Br-、I-、CN-、SCN-、S2O32-、NH3

；Ba2+

：F-、SO42-、EDTA；…………常用掩蔽劑：4）共存離子干擾的消除②選擇適當(dāng)?shù)娘@色反應(yīng)條件③分離干擾離子沉淀、離子交換、溶劑萃取操作較繁瑣，易引起誤差Fe3+

與磺基水楊酸反應(yīng)

pH=2.5時(shí)，消除Cu2+干擾Fe3++SS2-=［Fe(SS)]+如：控制酸度Fe3++2SS2-=［Fe(SS)2]-Fe3++3SS2-=［Fe(SS)3]3-紫紅色pH=4～8pH=8～11.5橙紅色黃色pH=1.8～2.54.測量條件的選擇

一般應(yīng)該選擇λmax為入射光波長。如果λmax處有共存組分干擾時(shí)，則應(yīng)根據(jù)“吸收大，干擾小”的原則，考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。1）選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL2）選擇合適的參比溶液

為什么需要使用參比溶液？

測得的的吸光度真正反映待測溶液吸光強(qiáng)度。參比溶液的選擇一般遵循以下原則：

①溶劑參比

僅待測組分在測定波長處有吸收，其它所加試劑均無吸收；②試劑參比

若顯色劑或其它所加試劑在測定波長處略有吸收；③試樣空白若待測試液在測定波長處有吸收，而