轉(zhuǎn)錄因子B在乳腺癌發(fā)生過程中作用的研究

轉(zhuǎn)錄因子B在乳腺癌發(fā)生過程中作用的研究某課題組在比較正常人和乳腺癌病人乳腺細胞的基因表達譜（GeneChipArray）工作中，發(fā)現(xiàn)新基因B編碼一個轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌病人細胞表達缺失，如何研究該新基因B？該基因在乳腺癌細胞中缺失該基因編碼一個轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)拿到了基因表達譜，知道都有哪些蛋白表達與正常細胞有差異發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象研究內(nèi)容研究B基因的構(gòu)成探究基因B表達缺失的原因?qū)ふ一駼編碼的轉(zhuǎn)錄因子在信號傳遞過程和生物合成過程中的上下游蛋白，以及與轉(zhuǎn)錄因子B相互作用的蛋白探究基因B與乳腺癌的關(guān)系實驗?zāi)康募皩嶒灢牧蠈嶒災(zāi)康模禾骄哭D(zhuǎn)錄因子B在乳腺癌發(fā)生過程中的作用實驗材料：人乳腺細胞HBL-100昆明系小鼠大腸桿菌B基因的構(gòu)成測序blastB基因是否做過分析基因構(gòu)成，內(nèi)含子，外顯子，重復(fù)序列及調(diào)控序列B基因的結(jié)構(gòu)研究PCR擴增B基因PCR在B基因上加FLAG-tag(ATGGATTACAAGGATGACGACGATAAG)構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)染進入大腸桿菌，擴增B轉(zhuǎn)錄因子破碎細胞，用FLAGresin過柱子提純B轉(zhuǎn)錄因子FLAGTag蛋白質(zhì)樣品蛋白質(zhì)晶體X射線晶體衍射譜晶體結(jié)構(gòu)模型晶體電子密度基因克隆表達天然生物組織功能研究結(jié)構(gòu)功能關(guān)系分析B蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究技術(shù)流程概況探究基因B表達缺失的原因表達缺失基因BmRNA蛋白DNA探針或PCRPCR無法擴增或探針檢測不到基因B缺失PCR可以擴增或單針可以檢測PCR可以擴增，基因表達，無法擴增得到cDNA抑制子作用增強（表達）被silenced修飾（甲基化等）測序，看剪接修飾、定位序列測序，看突變定位折疊降解連接報告基因檢測純化解結(jié)構(gòu)表達譜看酶以及其他底物等有沒有問題基因B及產(chǎn)物在信號通路中的作用上游蛋白（控制基因B轉(zhuǎn)錄翻譯TF）相互作用蛋白（與TF相互作用控制轉(zhuǎn)錄）下游基因（TF結(jié)合基因）尋找上游蛋白利用調(diào)控蛋白和promoter區(qū)的結(jié)合將調(diào)控蛋白提取，純化后質(zhì)譜或者查找已知的與基因B調(diào)控序列有相似序列的基因，篩出有可能結(jié)合的調(diào)控元件，用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）進行驗證后確定。ChIP在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化，以及DNA的鑒定。B轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白CoIP酵母雙雜交，BiFC，F(xiàn)RETCoIP免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。免疫共沉淀的設(shè)計理念是，假設(shè)一種已知蛋白是某個大的蛋白復(fù)合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可能將整個蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來（常說的“pull-down”），進而可以用于鑒定這個蛋白復(fù)合物中的其他未知成員。尋找下游基因1.ChIP--找到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列測序或者將DNA片段打斷讓TF結(jié)合后過濾純化，然后將TF洗脫后測序。2.blast比對（如果該基因是存在的，則下游通路已知）3.此處我們假設(shè)該基因是新基因，我們命名為geneC？驗證上下游關(guān)系材料：HBL100siRNA沉默基因B，看基因C的表達（RT-PCR或者WesternBlotting）siRNA沉默基因C，看基因B的表達（RT-PCR或者WesternBlotting）對基因C的探究？同源序列比對，預(yù)測功能C基因加GFP，亞細胞定位細胞質(zhì)：通過CoIP，找出有相互作用的蛋白。細胞膜：受體等。細胞核：轉(zhuǎn)錄因子、酶等。驗證B基因在乳腺癌發(fā)生中的作用初步驗證：

siRNA沉默基因B，觀察小鼠出現(xiàn)的腫塊，驗證B基因確實在乳腺癌發(fā)生中起作用。回補？測試B基因在其他類型腫瘤發(fā)生中的作用。

IHC（ICC）、westernblottingRNA干涉（RNAi）RNA干涉（RNAi）在實驗室中是一種強大的實驗工具，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。在ATP的參與下，細胞中存在的一種RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA-inducedsilencingcomplex，siRNA會并入RISC中，然后降解只與siRNA序列互不配對的靶標基因。免疫組化技術(shù)抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究。先將組織或細胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微