滇金絲猴檢疫技術(shù) 第1部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

1DB53/TXXXX—2021滇金絲猴檢疫技術(shù)第1部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范重要提示：本文件涉及人獸共患病原體的操作，應(yīng)在符合國(guó)家相關(guān)生物安全規(guī)定（GB19489和NY/T541）的條件下進(jìn)行。本文件遵循3R原則開(kāi)展動(dòng)物試驗(yàn)。本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）檢疫技術(shù)中產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的總則、產(chǎn)氣莢膜梭菌分型、儀器設(shè)備和試劑、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。本文件適用于滇金絲猴檢疫技術(shù)中產(chǎn)氣莢膜梭菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridiumperfringens產(chǎn)氣莢膜梭菌舊稱魏氏梭菌，為梭狀芽孢桿菌屬中的一種厭氧革蘭陽(yáng)性桿菌，屬于條件性致病菌，主要分布于動(dòng)物胃腸道，通過(guò)分泌外毒素發(fā)生致病作用。3.23R原則開(kāi)展涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的科學(xué)研究，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采取減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）的動(dòng)物福利保障措施。3.3細(xì)菌生化試驗(yàn)Biochemicaltestsforbacteria根據(jù)不同種類細(xì)菌產(chǎn)生的酶系統(tǒng)及其可分解底物的種類的差異，測(cè)定代謝產(chǎn)物種類用來(lái)區(qū)別和鑒定細(xì)菌。3.4外毒素Exotoxin病原細(xì)菌分泌、釋放于其生存環(huán)境或動(dòng)物體內(nèi)的毒性蛋白質(zhì)或多肽，能結(jié)合并破壞宿主細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能。2DB53/TXXXX—20213.5小鼠接種試驗(yàn)Inoculationtestinmice小鼠接種試驗(yàn)包括小鼠毒性試驗(yàn)和毒素中和試驗(yàn)，用于鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌及其外毒素類型。3.6保定Physicalrestraint采用化學(xué)或物理方式，讓動(dòng)物固定保持某種姿勢(shì)或某個(gè)體位，以便于救護(hù)人員進(jìn)行檢查、采樣和治療?？捎寐樽硭幬锘蜴?zhèn)定劑保定，也用特制籠具、平臺(tái)、布袋、繩索以及其它方式保定。3.7TA克隆TAcloning使用TaqDNA聚合酶做PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，憑借其DNA鏈的3?-端堿基A與質(zhì)粒載體（如pMD18-T或pMD19-T）的5?-端堿基T互補(bǔ)配對(duì)，將PCR產(chǎn)物插入質(zhì)粒載體。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。Amp：氨芐青霉素Ampecillinbp：堿基對(duì)BasepairBHI：腦心浸液BrainheartinfusionBLAST：基于局部序列比對(duì)算法的搜索工具BasiclocalalignmentsearchtoolddH2O：雙蒸水DoubledistilledwaterCPA：產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素ClostridiumperfringensαtoxinCPB：產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素ClostridiumperfringensβtoxinCW：魏氏梭菌ClostridiumwelchiiDNA：脫氧核糖核酸DeoxyribonucleicacidETX：ε毒素εtoxinITX：ι毒素ιtoxinPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReactionSPS：亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶Sulfite-Polymyxin-SulphadiazineTAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸鈉Tris-Acetate-EDTATris：三羥甲基氨基甲烷Tris(hydroxymethyl)aminomethaneTSC：胰蛋白?-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸Tryptose-Sulphite-Cycloserine5總則5.1培養(yǎng)特性：對(duì)滇金絲猴開(kāi)展產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)，采集新鮮的腹瀉糞便樣品，經(jīng)增菌厭氧培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種細(xì)菌于選擇性瓊脂培養(yǎng)基繼續(xù)做厭氧培養(yǎng)，獲得具有溶血能力、暴烈發(fā)酵含鐵牛乳特性,并在SPS或TSC瓊脂形成黑色菌落的分離菌株。5.2形態(tài)觀察：對(duì)分離菌株做革蘭染色和芽孢染色鏡檢，排除不符合產(chǎn)氣莢膜梭菌基本形態(tài)學(xué)特征的其他桿菌，減少得出假陽(yáng)性結(jié)果的可能。5.3生化試驗(yàn)：做細(xì)菌生化試驗(yàn)，將符合氣莢膜梭菌生化特性的分離菌株基本確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，進(jìn)一步排除非目標(biāo)菌種。5.4動(dòng)物試驗(yàn)：取符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生化特性的分離菌株，制備培養(yǎng)物上清濾過(guò)液，做小鼠毒性試驗(yàn)和毒素中和試驗(yàn)，從致病性角度對(duì)分離菌株做出產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種及毒素型的常規(guī)判定。3DB53/TXXXX—20215.5分子鑒定：通過(guò)PCR擴(kuò)增分析分離菌株的16SrRNA基因和4種毒素基因，得出最終鑒定結(jié)果。6產(chǎn)氣莢膜梭菌分型根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的外毒素種類，傳統(tǒng)上將該菌分為A、B、C、D、E五個(gè)毒素型：a)A型只產(chǎn)生α毒素；b)B型產(chǎn)生α、β、ε三種毒素；c)C型產(chǎn)生α、β兩種毒素；d)D型產(chǎn)生α、ε兩種毒素；e)E型產(chǎn)生α、ι兩種毒素。7儀器設(shè)備和試劑7.1采樣用品7.1.1個(gè)人防護(hù)裝備：包括防護(hù)服、乳膠或聚乙烯手套、+/-N95或FFP2面罩、護(hù)目鏡、鞋套等。7.1.2樣品采集及記錄用品：包括裝有保存介質(zhì)的采樣管或無(wú)菌空容器、動(dòng)物檢疫器械箱、醫(yī)用棉簽、剪刀、鑷子、一次性注射器、酒精棉、碘伏棉、酒精燈、封口袋、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆、記錄表格等。7.1.3樣品暫存運(yùn)輸裝備：包括保溫箱、冰盒或液氮容器、吸水填充材料、包裝膠帶、警示標(biāo)識(shí)等。7.1.4樣品保存裝備：冰箱（4℃、–20℃)、液氮罐等。7.1.5保定用品：包括操作籠、防咬嘴套、眼罩和麻醉藥物（如氯胺酮注射液）或鎮(zhèn)靜藥物（如舒泰）。7.2實(shí)驗(yàn)材料酒精棉球、厭氧試管（含硫代乙醇酸鈉等還原劑）、厭氧肉肝湯培養(yǎng)基（或BHI培養(yǎng)基）、SPS瓊脂、TSC瓊脂、CW瓊脂、含0.02%疊氮鈉的綿羊血瓊脂、梭菌增菌培養(yǎng)基、含鐵牛乳培養(yǎng)基、革蘭染色液、雪-?。⊿chaeffer-Fulton）染色液；細(xì)菌生化鑒定管；TaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T載體（如pMD18-T或pMD19-T）、感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞（DH-5α菌株）；毒素分型血清、小鼠、產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因和16SrRNA基因特異性引物（見(jiàn)附錄A.1）、PCR擴(kuò)增試劑（見(jiàn)附錄A.2）。7.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備厭氧罐（或厭氧培養(yǎng)箱）、低溫冰箱、–80℃冰箱、保溫箱、試管、離心管、離心機(jī)、一次性過(guò)濾器（濾膜孔徑0.22μm）、光學(xué)顯微鏡、恒溫?fù)u床、水浴鍋、微量移液器、PCR儀、電泳儀、照膠儀。8樣品8.1采樣要求8.1.1采樣人員應(yīng)為獸醫(yī)或動(dòng)物保護(hù)相關(guān)的專業(yè)技術(shù)人員。8.1.2開(kāi)展采樣工作前，應(yīng)了解、掌握采樣區(qū)域內(nèi)滇金絲猴的種群數(shù)量、活動(dòng)規(guī)律、生活習(xí)性及保定方法，制定樣品采集、運(yùn)輸和保存等完整的技術(shù)方案，并辦理樣品采集和運(yùn)輸相關(guān)手續(xù)，確保采樣過(guò)程的科學(xué)性、安全性以及樣品的可溯源性。樣品可采集動(dòng)物園或飼養(yǎng)基地圈養(yǎng)的滇金絲猴，但應(yīng)得到相應(yīng)主管部門的許可。4DB53/TXXXX—20218.1.3采樣安全與防護(hù)。采樣人員應(yīng)規(guī)范穿戴全套個(gè)人衛(wèi)生安全防護(hù)裝備做好自我防護(hù)。與樣品直接接觸的器具均應(yīng)提前做滅菌處理以防樣品被污染。應(yīng)準(zhǔn)備垃圾袋帶回采樣過(guò)程中產(chǎn)生的所有廢棄物品，防止環(huán)境污染和造成疫病傳播。8.1.4采樣完成后，所使用的器械、容器、個(gè)人防護(hù)用品等均要進(jìn)行無(wú)害化處理。8.2采樣程序8.2.1采集滇金絲猴糞便時(shí)選取新鮮（未干涸變色變形）糞便，同一堆糞便只采集一份樣品（可分裝于多只采集管），采集糞便內(nèi)部部分。8.2.2采集糞便時(shí)用棉簽蘸取糞便放入對(duì)應(yīng)采集管中，每采集一份樣品更換一個(gè)棉簽，并做好樣品標(biāo)記和采樣記錄。記錄表包括樣品編號(hào)、采集管數(shù)、種群、采集地名、采集日期、采集人、糞樣新鮮程度、生境狀況等采樣信息。糞便樣品采集應(yīng)填寫《滇金絲猴糞便樣品采集記錄表1》（見(jiàn)附錄B中表B.1）和《滇金絲猴糞便樣品采集記錄表2》（見(jiàn)附錄B中表B.2）。8.3樣品保存與運(yùn)輸8.3.1糞便置于無(wú)菌的螺蓋厭氧試管或含硫代乙醇酸鈉的封口塑料袋中保存。8.3.2采集或處理的樣品在4℃條件下保存不超過(guò)24h；若長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于–80℃冰箱。8.3.3樣品應(yīng)放入預(yù)先加入冰袋的保溫箱內(nèi)并及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室檢查。9試驗(yàn)步驟9.1細(xì)菌分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性觀察9.1.1將所采每份樣品振蕩混勻，接種于厭氧肉肝湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h～24h。9.1.2用接種環(huán)蘸取少量菌液涂布于SPS平板、TSC平板、CW平板和綿羊血瓊脂平板，置于厭氧罐（箱），37℃厭氧培養(yǎng)18h～24h；在含鐵牛乳培養(yǎng)基于46℃厭氧培養(yǎng)2h～5h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。9.1.3把平板上形成有明顯溶血環(huán)的單菌落挑取加入梭菌增菌培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24h，獲得分離菌株，用于進(jìn)一步的鑒定。9.2革蘭染色和芽孢染色鏡檢取細(xì)菌純培養(yǎng)物或糞樣做革蘭染色和雪-浮染色（見(jiàn)附錄C鏡檢細(xì)菌個(gè)體及芽孢形態(tài)。9.3細(xì)菌生化試驗(yàn)按生化鑒定管說(shuō)明書(shū)操作，將9.1.3培養(yǎng)得到的菌液接種于分別含酪蛋白、卵磷脂酶、吲哚、脂酶、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、硝酸鹽、明膠和水楊苷的生化鑒定管，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)及發(fā)酵情況。9.4小鼠接種試驗(yàn)9.4.1小鼠毒性試驗(yàn)將產(chǎn)氣莢膜梭菌分離菌株接種于綿羊血平板，37℃厭氧培養(yǎng)24h后挑取具有典型溶血環(huán)的單菌落，轉(zhuǎn)接至厭氧肉肝湯培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)14h～16h。按照5%的體積比轉(zhuǎn)接到厭氧肉肝湯培養(yǎng)基或BHI培養(yǎng)基，于43℃厭氧振蕩（250r/min）培養(yǎng)6h，12000r/min離心15min取上清，用0.22μm濾膜過(guò)濾，獲得外毒素。取外毒素做2倍連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度接種一組實(shí)驗(yàn)小鼠，5只實(shí)驗(yàn)小鼠為一組，每只腹腔內(nèi)注射0.3mL。對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)注射經(jīng)60℃/30min處理的濾過(guò)上清。連續(xù)觀察48h，記錄小鼠發(fā)病及死亡情況。5DB53/TXXXX—20219.4.2毒素中和試驗(yàn)在滅菌試管內(nèi)，用已知α、β、ε和ι毒素特異性的抗毒素（毒素分型血清分別與未經(jīng)加熱處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)物上清輕輕攪拌混合，放置于室溫孵育30min，再腹腔注射5只實(shí)驗(yàn)小鼠。9.516SrRNA基因與4種毒素基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析9.5.1細(xì)菌基因組DNA提取按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組（包括染色體和質(zhì)粒）DNA，保存于–20℃冰箱備用。9.5.2PCR擴(kuò)增16SrRNA基因PCR體系見(jiàn)附錄A.2，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，54℃退火30s，cpb、etx和itx）的PCR擴(kuò)增程序，除退火溫度分別設(shè)置為50℃、50℃、50℃和52℃,其他9.5.3凝膠電泳檢查用天平稱取0.3g瓊脂糖，加入到100mL規(guī)格的錐形瓶中，量取30mL1×TAE加入其中，置于微波爐加熱至瓊脂糖完全融化；待瓊脂糖凝膠略降溫后加入3μL核酸染料，倒入制膠模具中，室溫靜置20min，待其完全凝固；將膠放入電泳槽內(nèi)進(jìn)行點(diǎn)樣和加入DL2000DNAMaker。加樣后進(jìn)行電泳，電壓100V（8～10V/cm凝膠長(zhǎng)度），持續(xù)時(shí)間約30min。將電泳后的凝膠放入凝膠成像儀器中，在紫外光照射下觀察條帶是否符合預(yù)期的擴(kuò)增片段大?。ㄒ?jiàn)附錄A.1）。9.5.4TA克隆與測(cè)序分析對(duì)16SrRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期大小的條帶，進(jìn)行膠回收并按常規(guī)方法（見(jiàn)附錄D）做TA克隆，選取陽(yáng)性克?。ň洌┙?jīng)液體培養(yǎng)而成的懸液送專業(yè)機(jī)構(gòu)測(cè)序。與GenBank收錄的基因序列進(jìn)行在線BLAST對(duì)比以確定分離菌株的種屬地位及毒素類型。10試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理10.1細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果判定產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS平板上多為黑色菌落；在TSC平板上多為黑色菌落，周圍有一層不透明的暈圈；在CW平板上多為近圓形、微隆起、表面有皺褶、中等大小的菌落，菌落周圍有直徑為10mm～14mm的白濁環(huán)；在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上可形成直徑約2mm～5mm、表面光滑、半透明、圓頂型的菌落，菌落周圍可見(jiàn)雙層溶血環(huán)；在含鐵牛乳培養(yǎng)基出現(xiàn)暴烈發(fā)酵，乳凝結(jié)物破碎形成海綿樣物質(zhì)。觀察到上述菌落形態(tài)，并暴烈發(fā)酵含鐵牛乳培養(yǎng)基，則認(rèn)為分離菌株符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型培養(yǎng)特性。10.2染色鏡檢結(jié)果判讀產(chǎn)氣莢膜梭菌兩端鈍圓，呈單個(gè)或成雙排列，偶見(jiàn)鏈狀；芽胞為橢圓形，雪-浮染色呈綠色，位于菌體中央或次極端，在芽孢體即內(nèi)含芽孢的細(xì)菌，芽胞直徑不超過(guò)菌體寬度。鏡檢看到產(chǎn)生芽孢的革蘭陽(yáng)性短粗大桿菌，符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的形態(tài)學(xué)特征。10.3生化試驗(yàn)結(jié)果判定6DB53/TXXXX—2021根據(jù)發(fā)酵管（含pH值指示劑）顏色的變化，分離菌株若不能分解利用酪蛋白、吲哚、脂酶和水楊苷，但能分解利用卵磷脂酶、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、硝酸鹽和明膠，則認(rèn)為符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型生化特性。10.4小鼠毒性試驗(yàn)結(jié)果判定若接種細(xì)菌培養(yǎng)上清濾過(guò)液的小鼠在18h內(nèi)出現(xiàn)死亡，而對(duì)照組未見(jiàn)死亡，則符合產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的典型特征。否則判為產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素陰性。10.5毒素中和試驗(yàn)結(jié)果判定基于抗原抗體反應(yīng)的特異性，若接種經(jīng)抗體處理的某型毒素的實(shí)驗(yàn)小鼠不再發(fā)病死亡，便可判定毒素類型，進(jìn)而根據(jù)分離菌株所產(chǎn)生的毒素種類確定產(chǎn)氣莢膜梭菌分型。10.6核酸檢測(cè)結(jié)果判定10.6.1產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)除染色鏡檢見(jiàn)到能產(chǎn)生芽孢的革蘭陽(yáng)性粗大桿菌，生化試驗(yàn)結(jié)果與10.3描述一致，還需滿足下列3個(gè)條件之一：a)符合10.1所描述的細(xì)菌培養(yǎng)特性；b)毒素接種試驗(yàn)結(jié)果與10.4描述一致；c)分離菌株的16SrRNA基因擴(kuò)增片段與預(yù)期相符，其序列與產(chǎn)氣莢膜梭菌參考序列的同源性超過(guò)97%。10.6.2產(chǎn)氣莢膜梭菌分型標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)毒素中和試驗(yàn)（見(jiàn)10.5）或毒素基因PCR擴(kuò)增（見(jiàn)9.5）的結(jié)果判定：a)僅檢測(cè)到α毒素或其基因cpa的菌株，判定為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌；b)同時(shí)檢測(cè)到α、β、ε三種毒素或其基因cpa、cpb和etx的菌株，判定為B型產(chǎn)氣莢膜梭菌；c)同時(shí)只檢測(cè)到α、β兩種毒素或其基因cpa和cpb的菌株判定為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；d)同時(shí)只檢測(cè)到α、ε兩種毒素或其基因cpa和etx的菌株，判定為D型產(chǎn)氣莢膜梭菌；e)同時(shí)只檢測(cè)到α、ι兩種毒素或其基因cpa和itx的菌株，判定為E型產(chǎn)氣莢膜梭菌。7DB53/TXXXX—2021（規(guī)范性）引物和16SrRNA基因PCR擴(kuò)增體系毒素基因引物和16SrRNA基因引物見(jiàn)表A.1。表A.1毒素基因引物和16SrRNA基因引物16SrRNA基因PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表A.2。表A.216SrRNA基因PCR擴(kuò)增體系8DB53/TXXXX—2021（規(guī)范性）采樣記錄表滇金絲猴糞便樣品采集記錄見(jiàn)表B.1。表B.1滇金絲猴糞便樣品采集記錄表9DB53/TXXXX—2021（規(guī)范性）革蘭染色和雪-浮染色方法C.1革蘭染色程序C.1.1取細(xì)菌懸液或菌落樣品少許做低密度涂片，風(fēng)干。C.1.2用酒精燈適度加熱做物理固定。C.1.3滴加草酸銨?結(jié)晶紫溶液進(jìn)行初染3min～5min，輕輕用蒸餾水洗去染料。C.1.4滴加15%盧戈