第五章 動物細胞染色體工程

下篇：動物細胞工程實踐之Ⅱ第五章動物細胞染色體工程本章主要內(nèi)容5.1自然界的多倍表達象多倍體、體細胞多倍體及由配子形成的多倍體、多倍體分類5.2人工誘導多倍體動物***人工誘導多倍體的機制、誘導多倍體動物的方法5.3單性生殖與人工誘導雌、雄核發(fā)育***高等動物的單性生殖、卵母細胞孤雌激活的機理、Hertwig效應5.4動物染色體結構的改造5.5人工染色體酵母人工染色體、細菌人工染色體、哺乳類人工染色體理論根底：細胞遺傳學植物(Plant)物種染色體數(shù)目〔2n=〕人46小白鼠40非洲爪蟾36蛙26果蠅8線蟲2家蠶56豬38馬64牛60綿羊54雞78物種染色體數(shù)目〔2n=〕擬南芥10水稻24普通小麥42大麥14玉米20煙草48陸地棉52大豆40西瓜22動植物染色體數(shù)動物〔Animal〕2個5.1自然界的多倍表達象(1)多倍體〔Polyploid〕--指個體每個細胞中含有3個或3個以上的染色體組〔genome〕染色體組：指配子中所包含的染色體或基因的總和。單倍體：體細胞中含有本物種配子的染色體數(shù)目的個體。根據(jù)細胞中染色體組數(shù)目的不同稱為三倍體(tripliod)、四倍體〔tetrapliod〕、五倍體〔pentapliod〕等。5.1.1概念為什么植物中多倍體較多、動物中較少？--是進化的結果，是生活方式的反響。---植物:固著為生，必須耐受極端環(huán)境的改變，染色體多能增加遺傳的表型易變性。---動物:可動，能避開惡劣環(huán)境生存。多倍體多見于高等植物,如小麥、棉花、煙草、蘋果、梨等，動物少見。(2)動物中的天然多倍體早先以為幾乎所有動物都是二倍體。在20世紀60年代發(fā)現(xiàn)一種美洲角蛙是四倍體。之后,在低等脊椎動物包括魚類、兩棲類和爬行類中也有發(fā)現(xiàn)；魚類多倍體相對較多，虹鱒、鯉魚、泥鰍和鯽魚(Carassiusauratus)等就是天然多倍體。在人類也發(fā)現(xiàn)有三倍體。人類三倍體問題

有人曾報道了230例三倍體流產(chǎn)胎兒和33例產(chǎn)后幸存的三倍體嬰兒臨床資料。發(fā)現(xiàn)，三倍體胎兒都是二倍體和三倍體的“嵌合體〞。一例三倍體嬰兒，小頭、并指、遲鈍，血細胞培養(yǎng)幾乎完全是二倍體，但原皮培養(yǎng)中約92%的細胞是三倍體，其余8%是二倍體。產(chǎn)生原因：三種情況：2個精子入卵〔占66.4%〕；二倍體精子與單倍體的卵受精〔減數(shù)分裂過程中染色體未別離〔占23.6%〕；二倍體的卵與單倍體的精子受精〔10%〕。(3)體細胞多倍體、配子多倍體①體細胞形成多倍體原因:其一,成體體細胞在有絲分裂的過程中，染色體完成了復制，著絲點已分裂，但細胞受到外界環(huán)境條件(如溫度驟變)或生物體內(nèi)部因素的干擾，紡錘體形成受到破壞，以致染色體未被拉向兩極，形成的染色體數(shù)目增加。如果這樣的細胞繼續(xù)進行正常的有絲分裂，就發(fā)育成染色體數(shù)目加倍的組織。第二,受精卵在分裂時，遇到特殊環(huán)境，會使整套染色體數(shù)目加倍。前者可造成軀體某局部的染色體數(shù)目加倍；后者可使發(fā)育的個體所有細胞中的染色體數(shù)目加倍。②由配子形成的多倍體。在配子形成減數(shù)分裂過程中，染色體沒有減半，就會產(chǎn)生染色體數(shù)目加倍的配子。染色體數(shù)目加倍的配子在受精以后會發(fā)育成多倍體。因此，多倍體可以發(fā)生在個體發(fā)育的不同階段：或配子期、或卵裂期、或體細胞分裂期。①同源多倍體:--系指來源于同一個物種的二倍體以上的個體。成因：第一，有絲分裂異常。體細胞：在有絲分裂過程中染色體分裂而細胞不分裂，使“2n〞變成“4n〞。第二，減數(shù)分裂異常。配子：性細胞在減數(shù)分裂過程中染色體未發(fā)生別離，形成的配子仍是二倍體。如果2nX2n→4n；如果2nX1n→3n。②異源多倍體：---系指來源于不同的種間或屬間物種雜交產(chǎn)生的染色體數(shù)大于二倍體的個體。--成因：先通過種間或遠緣雜交，再經(jīng)染色體加倍而產(chǎn)生異源多倍體。(4)多倍體分類③異倍體/非整倍體--指某一個體在完整的正常染色體中缺失或額外增加個別染色體。如果配子第一次減數(shù)分裂不正常，第二次減數(shù)分裂正常，那么某對同源染色體就會不別離而同時進入一極。導致另一極中一個配子缺少一條同源染色體，從而形成n+1和n-1兩種配子。如果第一次減數(shù)分裂正常，而在第二次減數(shù)分裂異常時，就會形成n+1、n-1和n三種配子。相互受精結果：♂〔n-1〕X♀〔n〕→個體〔2n-1〕；♂〔n+1〕X♀〔n〕→個體〔2n+1〕；♂〔n+1〕X♀〔n+1〕→個體〔2n+2〕。5.2人工誘導多倍體動物5.2.1人工誘導多倍體的機制(2)抑制第一極體的排放5.2.2誘導多倍體動物的方法(1)生物學方法：主要采用雜交方法，尤其通過種間雜交獲得異源多倍體。劉思陽〔1987〕：用草魚〔2n=48〕♀×♂三角魴〔2n=48〕F1〔草魴雜種三倍體3n=72〕[可見，雌性草魚卵子第二極體的排放受到抑制。種間雜交抑制第二極體放出的機制尚不清楚，而種內(nèi)雜交時，極少有不排出第二極體的現(xiàn)象發(fā)生]有三種：生物學方法、物理學方法、化學方法(2)物理學方法①溫度休克法：冷休克法（0～5℃）熱休克法（約30℃）－用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克法誘導形成3n〔抑制第二極體排放〕或抑制第一次卵裂形成4n。優(yōu)點：廉價、易操作；常用。成功的關鍵：能否阻止第二極體的排出。需考慮三個因素：溫度處理的開始時間〔TA，從受精開始算起〕、第二，處理持續(xù)時間〔D〕和處理時的水溫〔T〕。影響因素很多，需要通過生物統(tǒng)計方法--正交試驗、方差分析，以獲得三因素組合的最正確值。②水靜壓法采用較高的水靜壓〔65kg/cm2〕抑制第二極體的排放或抑制受精卵第一次卵裂，產(chǎn)生多倍體。優(yōu)點：誘導率高〔在90%～100%〕，處理時間短，對受精卵損傷小，成活率高。缺點：需專用設備如水壓機，本錢較高，且處理卵的數(shù)量有限，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。③高鹽/高堿法

用高出常量濃度的鹽或堿抑制第二極體的放出或受精卵第一次卵裂，產(chǎn)生三倍體或四倍體。(3)化學方法5.2.3多倍體倍性鑒定〔直接法、間接法〕(1)測量核體積。多倍體細胞及細胞核比二倍體稍大。魚類，測量紅血球的核體積之比值方法。2n:3n=1:1.5;2n:4n=1:1.74；(2)蛋白質電泳：血清蛋白，只對特定物種可用。(3)生化成分分析：三倍體具有較二倍體的紅血球數(shù)量少，丙酮激酶活顯著高于二倍體等。(4)染色體計數(shù)：準確，但費時。(5)DNA含量測定：流式細胞儀〔Flowcytometry〕簡單、快速、準確測定出單細胞的DNA含量。5.3單性生殖與人工誘導的雌、雄核發(fā)育在生物的體細胞中，染色體的數(shù)目不僅可以成倍地增加，還可以成倍地減少。例如，蜜蜂的蜂王和工蜂的體細胞中有32條染色體〔受精的卵〕；而雄蜂的體細胞中只有16條染色體〔未受精的卵〕。單倍體：體細胞中含有本物種配子染色體數(shù)目的個體叫做單倍體。工蜂蜂王孤雌生殖蜜蜂飛行中婚配最強壯的雄峰與蜂王交尾后死去蜂王獲得終生享用的精子產(chǎn)卵受精卵雄峰（n=16）吃2-3天蜂王漿，經(jīng)21天發(fā)育吃5天蜂王漿經(jīng)16天發(fā)育幼蜂（2n=32）未受精卵圖5-1蜜蜂的生活周期雌蜂〔n=32〕5.3.1人工誘導雌、雄核發(fā)育雌、雄核發(fā)育即單性發(fā)育。是通過人工控制產(chǎn)生的單性種群。意義；純系建立、性別控制、遺傳機制研究。①“赫特威氏效應〞--Hertwig效應Hertwig效應實驗：②紫外線照射使染色體失活的機理-Hertwig效應原理紫外線與DNA作用時,在同一條多核苷酸鏈內(nèi)相鄰的胸腺嘧啶之間相互聯(lián)結,形成了胸腺嘧啶二聚體(ThymineDimers)，此種二聚體阻止了DNA的復制,從而導致了精子遺傳物質失活。紫外線照射可誘發(fā)突變和切斷染色體,當照射量到達一定值以上,染色體斷片脫落,精核萎縮,授精后雖然雄性原核化,但不能與雌核融合,不能正常發(fā)育。但可以激活雌核發(fā)育〔單倍體〕；如果雌核染色體加倍，就可形成正常二倍體動物。〔2〕雄核發(fā)育〔androgenesis)--將經(jīng)紫外線、X射線或γ射線等處理卵子后，與正常精子受精，再在適當時間施以冷、熱、高壓等物理方法處理，使精子染色體加倍與卵子結合，發(fā)育成完全為父本性狀的二倍體。人工誘導雄核發(fā)育研究較少。價值不大。5.3.3哺乳動物雌核發(fā)育--卵子的孤雌生殖(1)卵母細胞孤雌激活類型ABCC2C3圖5-3卵母細胞的孤雌激活類型AuraniandKaufman19775.4動物染色體結構的改造通過染色體片段的刪除和重排，產(chǎn)生攜帶特定染色體區(qū)片段缺失突變的動物，有助于在特定的染色體區(qū)實現(xiàn)系統(tǒng)的基因定位和功能分析。5.4.1染色體片段的刪除和重排〔1〕放射線誘導發(fā)生染色體缺失突變〔2〕Cre2loxP介導染色體重組Cre重組酶是在噬菌體P1中發(fā)現(xiàn)的一個38kDa的蛋白質，其名稱來源于causerecombination，它能識別34bp的特異序列〔loxP〕，介導兩個loxP之間的序列發(fā)生重組，從而將兩個loxP之間的序列刪除，此過程不需要任何其他輔助因子的幫助。loxP的位置和方向不同，由Cre重組酶介導重組形成的產(chǎn)物亦不相同，導致染色體發(fā)生倒位、刪除和易位等，從而實現(xiàn)染色體的定點操作。克服了用放射線誘導產(chǎn)生的突變不能定位的缺點，已被應用于果蠅、哺乳動物和植物染色體重組研究。通過小鼠染色體大片段的刪除和重排可以產(chǎn)生一些人為可見的表型。－－主要建立疾病動物模型來模擬人類的某些疾病，為研究腫瘤抑制基因的識別和疾病的治療診斷找到了捷徑。染色體大片段的刪除和重排的意義5.4.2染色體的易位〔translocation〕工程家蠶的性別控制與識別在實踐和理論上的都有重要意義。通過建立性別標記的限性系統(tǒng)，可提高生產(chǎn)收益。性別標記的限性系統(tǒng)是指某一標記性狀在雌、雄個體不同的遺傳系統(tǒng)。雄蠶繭比雌蠶繭出絲率高20%以上，體質比雌蠶要強壯。養(yǎng)蠶生產(chǎn)上所用一代雜交種〔大體上是雌、雄各一半〕，如果全是雄蠶，那么既不用增加本錢，又不多費勞力就可以增加10%~15%的蠶絲。桑蠶中的W染色體具有決定雌性的絕對功能。在W染色體上，除有決定雌性的基因外，還沒有發(fā)現(xiàn)能表現(xiàn)其它性狀的基因，但人們可以利用χ、γ等物理射線的照射處理，能使帶有標志基因的某個染色體片段易位到W染色體上，從而獲得好幾種限性遺傳的類型.近些年來，運用輻射誘變和染色體工程手段先后培育出有性別標記的限性蠶品種。目前生產(chǎn)上可利用的有卵色限性系，斑紋限性系和繭色限性系，卵色限性系已建立了一個較為完整的系統(tǒng)。圖２ＣＴＰＹИИИＫＯＢ的卵色限性系統(tǒng)

說明：ω２、ｗ3分別為第二白卵基因、第三白卵基因，+ω２、+ω3．分別為ω２、ω3的等位基因〔顯性〕，＋ω２、＋ω3，同時存在表現(xiàn)黑卵。載有ω２、ｗ3、+ω２、+ω3的是第10染色體。上世紀70年代ＣＴＰＹИИИＫＯＢ用輻射誘發(fā)了兩個第10染色體向ω染色體易位的品系，其中一個在易位的第10染色體片段中含有白卵基因ω3,另一個含有白卵基因ω２。由于+ω２與+ω3有互補作用，只有同時存在才表現(xiàn)黑卵，隱性ω２或ω3只要任何一個成純合型時，便表現(xiàn)白卵。這種易位雌體各同持有ω２／ω２或ω3／ω3的雄交配，分別得到黑色雌卵與白色雄卵，表現(xiàn)卵色限性遺傳。當這兩個品系互交時，就得到黑色雄卵和白色雌卵。采用這樣的品種進行原種繁育時，可由光電選卵機多項選擇黑卵雌蠶飼養(yǎng)，能提高制種能力、降低生產(chǎn)本錢。農(nóng)村養(yǎng)蠶用兩系的正反雜交F可選黑卵雄蠶飼養(yǎng)，以提高出絲率。蠶卵色限性系統(tǒng)5.5人工染色體染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復制和向子細胞中平均分配，它需要3個關鍵序列：其一，自主復制DNA序列〔autonomouslyreplicatingsequenceARS〕：是DNA復制的起點，確保染色體能夠開始自我復制。其二，著絲粒DNA序列〔centromereDNAsequenceCEN〕：確保染色體在細胞分裂時能平均分配到子細胞中。其三，端粒DNA序列〔telomereDNAsequenceTEL〕：使DNA能結束復制，確保染色體的獨立性和穩(wěn)定性。將自主復制DNA序列、著絲粒DNA序列和端粒DNA序列這3個關鍵序列組裝拼接后就得到人造微小染色體〔artificialminichromosome〕。應用：在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定等研究中得到了廣泛的應用，具有極為重要的價值。人造微小染色體的制備與應用目前正在研究或應用的人工染色體①酵母人工染色體〔yeastartificialchromosomeYAC〕、②細菌人工染色體〔bacterialartificialchromosomeBAC〕③哺乳動物人工染色體〔mammalianartificialchromosomeMAC〕。Fig.5-5人造基因5.5.1酵母人工染色體〔YAC〕1983年，Murray等人首次成功構建了包括著絲粒、端粒、復制子和外源DNA總長度為55kb的酵母人工染色體。1987年，Burke等人構建了能克隆大片段人體DNA分子的載體YAC。證明YAC可用來構建高等生物的完整基因組文庫，克隆容量達100～1000Kb。圖5-3YAC的構建自主復制序列色氨酸合成基因pYAC〔YAC質?！抽L約8kb，帶有人工染色體所需的一切元件。當要用它進行克隆時，先用BamHI和SmaI對它進行雙酶解，回收兩個臂，然后平末端的外源大片段DNA就可以兩個臂連接，形成真正意義上的人工染色體。色氨酸合成基因酵母菌著絲粒序列端粒復制原點酵母人工染色體的構建與其他克隆載體的構建程序相似：第一，包括大片段DNA的獲取；第二，YAC重組體的構建；第三，YAC重組體對酵母的轉化；第四，YAC基因庫的鑒定；第五，目的基因YAC克隆的篩選；第六，目的基因YAC克隆的鑒定。YAC存在一些缺點：YAC是目前容量最大的載體，但存在一些缺點：--①插入片段大，穩(wěn)定性較差；--②插入的大片段易發(fā)生缺失，使文庫不完整；--③插入片段易發(fā)生重排，造成序列錯誤；--④DNA片段來自兩個或兩個以上的染色體，使文庫中的嵌合現(xiàn)象