《聚合酶鏈反應(yīng)PCR》課件

《聚合酶鏈反應(yīng)pcr》ppt課件延時(shí)符Contents目錄PCR技術(shù)簡(jiǎn)介PCR實(shí)驗(yàn)流程PCR反應(yīng)體系與條件PCR產(chǎn)物分析PCR技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)PCR技術(shù)的改進(jìn)與發(fā)展延時(shí)符01PCR技術(shù)簡(jiǎn)介聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種在生物體外通過特定引物和耐高溫的DNA聚合酶，擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。定義基于DNA雙鏈復(fù)制的原理，通過高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸三個(gè)步驟循環(huán)，實(shí)現(xiàn)DNA片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。原理定義與原理1970年代，研究人員開始探索在體外擴(kuò)增DNA的方法。早期探索1985年，KaryB.Mullis在Cetus公司工作時(shí)發(fā)明了PCR技術(shù)。PCR技術(shù)的誕生隨后的幾年中，PCR技術(shù)經(jīng)歷了不斷的優(yōu)化和改進(jìn)，提高了靈敏度和特異性。技術(shù)改進(jìn)PCR技術(shù)迅速應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，包括遺傳病診斷、法醫(yī)學(xué)鑒定和生物分析等。廣泛應(yīng)用發(fā)展歷程遺傳病診斷法醫(yī)學(xué)鑒定生物分析農(nóng)業(yè)科學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域01020304通過PCR檢測(cè)基因突變，實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳病的早期診斷和產(chǎn)前篩查。利用PCR技術(shù)對(duì)微量DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用于法醫(yī)學(xué)中的個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。PCR技術(shù)用于分析生物樣本中的基因表達(dá)、基因組多態(tài)性和基因組編輯等。PCR技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因作物研究和品種鑒定，以及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)。延時(shí)符02PCR實(shí)驗(yàn)流程確保所需的試劑和儀器都已準(zhǔn)備好，包括DNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。材料準(zhǔn)備確保PCR儀的溫度循環(huán)設(shè)置正確，并已校準(zhǔn)溫度傳感器。儀器校準(zhǔn)準(zhǔn)備階段高溫處理將混合物加熱至95°C，使DNA雙鏈解開成單鏈。作用為引物與模板的結(jié)合創(chuàng)造條件。變性階段降溫處理將溫度降低至50-60°C，使引物與模板DNA結(jié)合。作用確保引物與模板DNA的特異性結(jié)合。退火階段在TaqDNA聚合酶的作用下，從引物起始點(diǎn)開始合成新的DNA鏈。聚合酶作用使DNA鏈得以延伸。作用延伸階段經(jīng)過預(yù)設(shè)的循環(huán)次數(shù)后，PCR反應(yīng)完成。通過電泳、熒光檢測(cè)等方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。終止反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)循環(huán)結(jié)束延時(shí)符03PCR反應(yīng)體系與條件通常為15-30個(gè)堿基，過短影響結(jié)合特異性，過長(zhǎng)影響擴(kuò)增效率。引物長(zhǎng)度引物序列引物GC含量應(yīng)與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)，避免形成引物二聚體。一般在40%-60%之間，過高或過低會(huì)影響PCR擴(kuò)增效率。030201引物設(shè)計(jì)DNA模板模板純度應(yīng)確保模板中無(wú)PCR抑制劑，如酚、氯仿等。模板量根據(jù)PCR擴(kuò)增效率和靈敏度需求確定，通常為10-100ng。dNTP濃度濃度過高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增效率。dNTP質(zhì)量應(yīng)確保dNTP純度高，無(wú)污染。dNTPsTaqDNA聚合酶確保酶活性正常，無(wú)失活現(xiàn)象。酶活性根據(jù)PCR反應(yīng)體系確定酶的濃度，濃度過高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。酶濃度VS含有維持TaqDNA聚合酶活性的必要離子，如Mg^2+。緩沖液濃度濃度過高或過低會(huì)影響PCR擴(kuò)增效率。緩沖液成分反應(yīng)緩沖液延時(shí)符04PCR產(chǎn)物分析

電泳檢測(cè)原理利用不同大小DNA片段在電場(chǎng)中的遷移率不同，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。通過觀察電泳結(jié)果，可以判斷PCR產(chǎn)物的大小是否符合預(yù)期。步驟配置合適的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物加入樣品孔，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，通過染料染色，觀察DNA條帶。優(yōu)缺點(diǎn)操作簡(jiǎn)單，成本低，但對(duì)操作要求較高，結(jié)果主觀性強(qiáng)。步驟在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增過程中，染料與DNA結(jié)合并發(fā)出熒光。擴(kuò)增結(jié)束后，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)。原理利用熒光染料與DNA結(jié)合后發(fā)出熒光信號(hào)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)判斷DNA的濃度。優(yōu)缺點(diǎn)自動(dòng)化程度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但對(duì)儀器要求較高。熒光檢測(cè)利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列比對(duì)、基因突變分析等。原理將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果輸入生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。通過比對(duì)已知基因序列，判斷是否存在基因突變或差異表達(dá)。步驟結(jié)果準(zhǔn)確，可進(jìn)行大規(guī)模數(shù)據(jù)分析，但對(duì)技術(shù)和硬件要求較高。優(yōu)缺點(diǎn)生物信息學(xué)分析延時(shí)符05PCR技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)PCR技術(shù)可以檢測(cè)出極微量的DNA，甚至單個(gè)分子也能擴(kuò)增出來(lái)。通過設(shè)計(jì)特異引物，PCR技術(shù)可以特異性地?cái)U(kuò)增特定的DNA片段，避免其他DNA的干擾。PCR反應(yīng)非常迅速，可以在短時(shí)間內(nèi)完成大量DNA的擴(kuò)增。PCR技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，容易掌握，適合于自動(dòng)化操作。高靈敏度特異性快速簡(jiǎn)單PCR技術(shù)需要特定的儀器和試劑，成本相對(duì)較高。成本高由于PCR的高靈敏度，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。易產(chǎn)生假陽(yáng)性如果樣品質(zhì)量不高，可能會(huì)影響PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)樣品質(zhì)量要求高PCR擴(kuò)增過程中，可能會(huì)產(chǎn)生交叉污染，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。易產(chǎn)生污染缺點(diǎn)延時(shí)符06PCR技術(shù)的改進(jìn)與發(fā)展常規(guī)PCR技術(shù)是最早的PCR技術(shù)，主要用于擴(kuò)增特定的DNA片段。常規(guī)PCR技術(shù)基于DNA雙鏈復(fù)制原理，通過DNA聚合酶的催化，以四種脫氧核苷酸為原料，在特定的引物引導(dǎo)下，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，從而實(shí)現(xiàn)特定DNA片段的擴(kuò)增?？偨Y(jié)詞詳細(xì)描述常規(guī)PCR技術(shù)總結(jié)詞反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)是將RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為cDNA，再通過PCR擴(kuò)增的技術(shù)。詳細(xì)描述反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)首先通過反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后利用PCR技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。該技術(shù)常用于檢測(cè)細(xì)胞或組織中特定基因的表達(dá)水平。反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）總結(jié)詞實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)過程中加入熒光染料，通過熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程。要點(diǎn)一要點(diǎn)二詳細(xì)描述實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，利用熒光信號(hào)的積累與PCR產(chǎn)物量成正比的原理，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA片段的定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）總結(jié)詞高通量PCR技術(shù)是一種能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)基