平面色譜法課件

平面色譜法27一月202450-2一、平面色譜法的分類：薄層色譜法（TLC）：將固定相于惰性硬質(zhì)板上涂成一薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法。其原理同柱層析。紙色譜法：屬分配色譜法，固定相為吸附于濾紙上的水分，流動(dòng)相一般為不與水混溶的有機(jī)溶劑。薄層電泳法：帶電荷的被分離物質(zhì)（如蛋白、核苷酸、多肽、糖類等）在惰性的支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠等）上，以不同泳動(dòng)速度向相反電極方向移動(dòng)而分離。19.1平面色譜法的分類和原理27一月202450-3二、平面色譜法參數(shù)1、定性參數(shù)比移值（retardationfoctor）

Rf=L/L0可用范圍：0.2～0.8最佳范圍：0.3～0.527一月202450-4相對(duì)比移值(relativeRf)：Rr＝Rf（i）/Rf（s）＝Li

/Ls

重現(xiàn)性和可比性較Rf好27一月202450-52、相平衡參數(shù)—K

和k

與Rf

的關(guān)系

Rf＝1/(1+k)＝1/(1+KVs/Vm)k,K＝0，Rf

＝1k,K＝∞，Rf

＝03、面效參數(shù)—n和H理論塔板數(shù)n：n

＝16(L/W)2塔板高度H：H

＝L0/nRf與R’類似27一月202450-64、分離參數(shù)分離度(resolution，R):

兩相鄰斑點(diǎn)中心距離與兩斑點(diǎn)平均寬度的比值。

R=2(L2－L1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)在平面色譜中，R應(yīng)大于127一月202450-7分離數(shù)（seperationnumber，SN）：

定義：在相鄰斑點(diǎn)分離度為1.177時(shí)，在Rf為0和1.0之間能完全分離的組分斑點(diǎn)數(shù)。SN越大，平面的容量越大，一般薄層板的SN

在10左右，高效薄層板可達(dá)20。計(jì)算SN:

(W1/2)0、(W1/2)1分別為由薄層色譜掃描所得的Rf＝0和Rf＝1的組分的半峰寬27一月202450-827一月202450-9薄層色譜法的主要類型吸附薄層色譜法：s－固體吸附劑分配薄層色譜法：s－吸留在載體表面的固定液和吸水達(dá)17%以上的硅膠。經(jīng)典薄層色譜法現(xiàn)代薄層色譜法19.2薄層色譜法27一月202450-10modernTLC

27一月202450-11薄層色譜法的一般流程27一月202450-12分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中；靈敏度高，幾十ng～幾μg即可檢出；速度快，幾至幾十min，一次可展開多個(gè)試樣；試樣處理簡(jiǎn)單，對(duì)被分離物質(zhì)性質(zhì)沒有限制；上樣量比較大，可以點(diǎn)狀或條狀點(diǎn)樣；儀器簡(jiǎn)單，操作方便，可保留彩色圖譜。應(yīng)用廣泛，尤其對(duì)藥物的鑒別，《中華人民共和國(guó)藥典》2010版中許多藥物采用此法。薄層色譜法的特點(diǎn)27一月202450-13

吸附劑，adsorbent1.硅膠

2.氧化鋁

3.聚酰胺一、薄層色譜的固定相27一月202450-141.硅膠（SiO2·H2O，silicagel）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部—硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)

表面—硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心適用范圍：硅膠具有微酸性，適于分析酸性或中性物質(zhì)27一月202450-15基本特性：易形成氫鍵：與極性物質(zhì)或不飽和化合物。物質(zhì)極性↑，吸附能力↑，不易洗脫。吸附活性次序：活潑型>束縛型>游離型吸附活性等級(jí)：與含水量有關(guān)，含水高，活性級(jí)數(shù)高，吸附能力弱?；罨c失活：吸水→失活→105～110OC烘干30-60min(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性喪失，無吸附力。27一月202450-1627一月202450-172.氧化鋁由氫氧化鋁在400～500℃灼燒而成種類特性使用范圍堿性氧化鋁混有碳酸鈉等成分而具堿性，pH約為9~10適合中性或堿性化合物的分離。尤其適合分離生物堿等堿性成分中性氧化鋁除去堿性成分水洗至中性而得，pH約為7~7.5適合于對(duì)酸堿性不穩(wěn)定的化合物酸性氧化鋁用稀硝酸或稀鹽酸處理而成，pH約為4~5中和了堿性雜質(zhì)，并帶有NO3—或Cl—，具一定的離子交換劑的性質(zhì)，適于酸性成分的柱色譜。27一月202450-18氧化鋁吸附活性：與含水量有關(guān)，水分增加，等級(jí)增大，活性降低。硅膠含水量%活性等級(jí)氧化鋁含水量%活化溫度05ⅠⅡ03300－400℃15Ⅲ6150－300℃2538ⅣⅤ1015100－150℃27一月202450-193.聚酰胺（polyamide）

聚酰胺（polyamide）為高分子聚合物。屬氫鍵吸附作用原理27一月202450-20聚酰胺的性質(zhì)：聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿和丙酮等常用溶劑，對(duì)堿比較穩(wěn)定。但對(duì)酸，尤其是無機(jī)酸穩(wěn)定性較差，可溶于濃鹽酸、冰乙酸和甲酸中。水溶液裝柱上樣：水使組分與聚酰胺之間形成氫鍵的締合能力增強(qiáng)，有利于聚酰胺對(duì)組分的充分吸附。常見溶劑對(duì)聚酰胺柱色譜的洗脫能力的順序：水＜甲醇＜丙酮＜?xì)溲趸c水溶液＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。27一月202450-211、選擇原則：三角律*二、展開劑(developer)27一月202450-222、常用溶劑極性強(qiáng)弱順序：水>酸>吡啶>乙腈>甲醇>乙醇>正丙醇>正丁醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯>三氯乙烷>四氯化碳>環(huán)己烷>石油醚3、展開劑選擇：?jiǎn)我蝗軇┖投嘣軇┫到y(tǒng)，根據(jù)分離情況通過多次實(shí)驗(yàn)去選擇。理想展開劑要求達(dá)到：

Rf=0.3～0.8,ΔRf≥0.0527一月202450-23制板→點(diǎn)樣→展開→顯色→分析1、薄層板的制備：軟板、硬板，自制或購(gòu)買商品板板材：玻璃、錫箔紙、塑料規(guī)格：涂鋪：無氣泡、勻漿、均勻、厚250μm活化：三、薄層色譜操作方法27一月202450-24制板設(shè)備和儀器27一月202450-25（1）點(diǎn)樣要求：合適的溶劑樣品濃度點(diǎn)樣量點(diǎn)樣位置樣點(diǎn)大小樣點(diǎn)間隔2、點(diǎn)樣27一月202450-26不同溶劑對(duì)斑點(diǎn)展開前后的影響27一月202450-27（2）點(diǎn)樣方式點(diǎn)狀點(diǎn)樣：方法一，借助毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣方法二，借助注射器式點(diǎn)樣器進(jìn)行點(diǎn)樣方法三，借助于點(diǎn)樣儀器進(jìn)行點(diǎn)樣帶狀點(diǎn)樣：斑點(diǎn)分辨率高、精密準(zhǔn)確，適合定量。自動(dòng)點(diǎn)樣：自動(dòng)點(diǎn)樣儀可由電腦和相應(yīng)的軟件控制吸樣、點(diǎn)樣、清洗等全過程，可點(diǎn)狀、帶狀及方形點(diǎn)樣。點(diǎn)狀為接觸式點(diǎn)樣，帶狀和方形為噴霧式點(diǎn)樣。27一月202450-28

點(diǎn)樣器與點(diǎn)樣效果27一月202450-29點(diǎn)樣前需注意：確認(rèn)板的清潔27一月202450-303、展開（1）展開方式：一維單向展開：二維雙向展開：強(qiáng)迫流動(dòng)展開27一月202450-31一維單向展開方式27一月202450-3227一月202450-33

27一月202450-34（2）影響展開的因素和注意事項(xiàng)①環(huán)境的相對(duì)濕度27一月202450-35（2）影響展開的因素和注意事項(xiàng)②溶劑蒸氣的影響：薄層色譜是固定相、液態(tài)展開劑相及展開室內(nèi)的蒸氣相共同構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜的色譜分離過程。展開室內(nèi)三相之間達(dá)到平衡的程度即飽和27一月202450-36飽和操作的必要性：重現(xiàn)性與克服邊緣現(xiàn)象27一月202450-37溫度：展開方式：展距：展開室的放置：

27一月202450-38結(jié)束展開：展距合適、標(biāo)前沿、除溶劑斑點(diǎn)定位方法：可見光下觀察紫外燈下觀察顯色劑顯色：通用：10%硫酸乙醇溶液；碘蒸氣；專用：碘化鉍鉀—生物堿；

三氯化鐵—黃酮；

茚三酮—氨基酸4、展開結(jié)束與斑點(diǎn)定位27一月202450-39

生物自顯影檢測(cè)系統(tǒng)生物自顯影檢測(cè)系統(tǒng)浸漬槽浸漬槽生物自顯影檢測(cè)系統(tǒng)27一月202450-40

光學(xué)檢測(cè)定位儀器27一月202450-41斑點(diǎn)比移值對(duì)照法：在多種展開系統(tǒng)中，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行Rf

值比較。四、薄層色譜的定性分析

27一月202450-42斑點(diǎn)顯色特征法：保存彩色圖譜四、薄層色譜的定性分析27一月202450-43薄層掃描法鑒別：四、薄層色譜的定性分析（1）斑點(diǎn)的原位光譜掃描定性

27一月202450-44（2）薄層色譜的全程掃描定性

27一月202450-45（3）薄層的三維掃描光譜圖定性

27一月202450-46（4）與其他方法聯(lián)合定性

TLC-MS聯(lián)用儀：

27一月202450-47定量分析：半定量和定量半定量方法：估計(jì)含量，如限量檢查；定量方法：間接定量——

洗脫測(cè)定直接定量——

薄層掃描測(cè)定：主要包括吸收掃描法和熒光掃描法五、定量分析27一月202450-481、薄層掃描定量分析的基本原理（1）薄層吸收掃描法的原理：郎伯比耳定律

透射比反射線性關(guān)系好27一月202450-49（2）薄層熒光掃描法的基本原理：

φ為效率常數(shù)；a為吸光系數(shù)；b為薄層斑點(diǎn)厚度27一月202450-502、薄層色譜掃描法定量分析方法（1）外標(biāo)法①外標(biāo)一點(diǎn)法：②外標(biāo)二點(diǎn)法：27一月202450-51③回歸方程計(jì)算法：27一月202450-52（2）內(nèi)標(biāo)法27一月202450-53（3）歸一化法采用該方法的條件是：被分析的各個(gè)組分在分子量、吸收系數(shù)等性質(zhì)上差別較小，組分斑點(diǎn)的面積均在線性范圍內(nèi)，樣品中所有組分均被分離且被有效掃描。27一月202450-541、薄層色譜掃描儀的基本構(gòu)成主機(jī)（硬件）：主機(jī)部分與分光光度計(jì)類似，由光源、分光系統(tǒng)、薄層板放置倉(cāng)（相當(dāng)于樣品池）、檢測(cè)器等數(shù)據(jù)處理與信號(hào)輸出系統(tǒng)（軟件）等部分組成。六、薄層色譜掃描儀27一月202450-552、薄層色譜儀的掃描方法掃描方法：一般采用雙波長(zhǎng)測(cè)定，可用反射法或透射法得到信號(hào)。掃描方式：線形、齒形、環(huán)形掃描，多通道掃描等六、薄層色譜掃描儀27一月202450-56薄層色譜掃描軟件27一月202450-57七、薄層色譜法在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用在中草藥與中成藥分析中的應(yīng)用中藥材的品種鑒別中成藥的鑒別中藥薄層指紋圖譜鑒別中草藥成分分析中成藥的含量測(cè)定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究等薄層色譜法在合成藥物分析中的應(yīng)用藥典僅限于合成藥的定性鑒別和純度檢查2010中國(guó)藥典二部采用TLC進(jìn)行鑒別和純度檢查的品種數(shù)量共435個(gè)（約占收載總數(shù)的19%）也用于含量測(cè)定、穩(wěn)定性考察、體內(nèi)藥物測(cè)定及代謝研究、生化藥物及抗菌素分析等。27一月202450-58專屬性較強(qiáng)的薄層色譜鑒別技術(shù)在2005年版《中國(guó)藥