食用菌選修課

第二章菌種制作技術(shù)

第一節(jié)制種的程序第二節(jié)

食用菌的菌種制作技術(shù)

第三節(jié)

消毒滅菌方法

第四節(jié)母種的別離培養(yǎng)第五節(jié)

菌種質(zhì)量的鑒定和保藏第六節(jié)

菌種制備過程中的幾個(gè)問題第七節(jié)

菌種生產(chǎn)的季節(jié)安排一、制種的程序

1.種菇的選擇及孢子的采集第一節(jié)制種的程序2.菌種別離3.母種培養(yǎng)4.原種的培養(yǎng)5.栽培種的培養(yǎng)第二節(jié)

食用菌的菌種制作技術(shù)

一、母種的制作1.母種的概念：又稱一級(jí)種，是指由孢子別離、菇木別離或組織別離所得到的試管種。2.母種培養(yǎng)基的種類〔1〕土豆：200g，糖20g，瓊脂20g；水1000mL?！?〕蛋白胨2g；糖20g，磷酸氫二鉀1g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g；水：1000mL。適用于多種食用菌?！?〕玉米粉40g，糖10g，瓊脂20g；水1000mL。3.母種培養(yǎng)基的配制

〔1〕按配方稱藥品〔2〕融化、過濾〔3〕裝試管：試管規(guī)格為18×180mm，裝量為管長(zhǎng)的1∕5，擦凈管口、塞松緊度適宜的棉塞?！?〕滅菌：121℃，30min〔5〕擺斜面：趁熱擺斜面，為管長(zhǎng)的1/2~3/5。4.接種〔1〕菌種外表消毒；〔2〕將菌種切割成2×4×2mm的小塊；〔3〕將菌種接到斜面中心略偏試管底部處；〔4〕1支試管種可接斜面30支左右。5.培養(yǎng)〔1〕最適培養(yǎng)溫度多數(shù)食用菌為25℃，木耳、銀耳28℃，草菇35℃?！?〕培養(yǎng)時(shí)間不同的菌種差異較大，一般為7~12天?！?〕協(xié)調(diào)的最適培養(yǎng)溫度比最適培養(yǎng)溫度低2~3℃，菌絲健壯。二、原種的制作1.原種的概念將母種接入瓶裝或袋裝的木屑、麥?；蚣S草等培養(yǎng)基內(nèi)所得到的菌種。2.原種培養(yǎng)基的種類

〔1〕木屑78%，麥麩20%，糖1%，石膏1%?！?〕棉籽殼88%，麥麩10%，糖1%，石膏1%?！?〕麥草50%，牛糞46.%，糖1%，石膏1%，過磷酸鈣1.5%，尿素0.5%。3.原種的配制〔1〕過篩、稱重〔2〕浸泡或直接拌料〔3〕裝瓶或袋松緊適宜、打孔、擦凈塑料袋規(guī)格：17×33cm瓶規(guī)格：菌種瓶、罐頭瓶。裝袋高壓蒸汽滅菌鍋：121℃,2~2.5小時(shí)；土蒸鍋：100℃，10小時(shí)?！?〕滅菌4.接種〔1〕菌種外表消毒；〔2〕將菌種斜面分成5等份；〔3〕將菌種接到瓶或袋裝培養(yǎng)基的頂部中心處；〔4〕1支試管種可接原種培養(yǎng)基5瓶〔袋〕左右。5.培養(yǎng)〔1〕最適培養(yǎng)溫度多數(shù)食用菌為25℃，木耳、銀耳28℃，草菇35℃?！?〕培養(yǎng)時(shí)間不同的菌種差異較大，一般為28~42天。三、栽培種的制作1.栽培種的概念將原種接入瓶裝或袋裝的木屑、麥?；蚣S草等培養(yǎng)基內(nèi)所得到的菌種。

2.裝袋、滅菌與原種相同3.接種〔1〕菌種外表消毒；〔2〕將菌種分成花生米或蠶豆大小的小塊；〔3〕將菌種接到袋裝培養(yǎng)基的兩側(cè)；〔4〕1瓶原種可接栽培種培養(yǎng)基30袋(兩頭接種)左右。4.培養(yǎng)與原種相同第三節(jié)

消毒滅菌方法

一、物理方法消毒滅菌1.高壓蒸氣滅菌

〔1〕排汽要徹底；〔2〕物體擺放要均勻；〔3〕棉塞要防潮；〔4〕滅菌時(shí)間物品的多少而定；〔5〕翻開滅菌鍋前要緩放汽。2.常壓蒸氣滅菌〔1〕滅菌溫度為100℃；〔2〕滅菌時(shí)間10小時(shí)左右；3.間歇蒸氣滅菌100℃滅菌1小時(shí)→間歇1天→100℃滅菌1小時(shí)→間歇1天→100℃滅菌1小時(shí)。4.干熱滅菌適合于瓶、試管口和接種工具。

5.紫外線〔1〕適合于空氣和物體外表消毒；〔2〕照射距離以1.2米最好，2米有效；〔3〕照射時(shí)間以20~30min；〔4〕照射環(huán)境應(yīng)黑暗。二、化學(xué)方法消毒滅菌1.酒精〔1〕濃度：70~75%〔2〕用于皮膚和器具外表消毒。2.甲醛〔1〕濃度：10mL/立方米；〔2〕用于空氣和物體外表消毒。3.高錳酸鉀〔1〕濃度：0.1%；〔2〕用于物體外表消毒。4.升汞〔HgCl2〕〔1〕濃度：0.1%；〔2〕用于非金屬器皿消毒。5.來蘇爾〔1〕濃度：1~3%；〔2〕操作人員的手、器皿和接種室噴霧消毒。6.生石灰〔1〕濃度：2~3%；〔2〕通過提高pH抑制雜菌生長(zhǎng)。7.多菌靈〔1〕濃度：0.1%；〔2〕用于拌料〔生料栽培〕，遇堿失效。8.菇保1號(hào)袋包粉末，接種前燃燒消毒第四節(jié)母種的別離培養(yǎng)食用菌生產(chǎn)用的種子是菌絲體，不用孢子；菌種質(zhì)量的優(yōu)劣影響產(chǎn)量和質(zhì)量。在自然界里，食用菌不是單獨(dú)存在的，而是和許多細(xì)菌、放線菌、霉菌等生活在一起的。所謂菌種別離，就是把食用菌從這些和食用菌一起生活的雜菌中別離出來，通過培養(yǎng)，獲得純的優(yōu)良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。食用菌母種的別離，可分為孢子別離法、組織別離法以及基內(nèi)菌絲別離等。一、孢子別離法是用食用菌的孢子萌發(fā)成菌絲，培養(yǎng)成菌種的方法。菌種生活力較強(qiáng)，但孢子個(gè)體之間有差異，自然分化現(xiàn)象較嚴(yán)重，變異大，需經(jīng)出菇試驗(yàn)才能用于生產(chǎn)。1.種菇的選擇選擇個(gè)體健壯、朵形圓正，無病蟲害、出菇均勻、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)的八九分成熟的種菇。2.種菇的消毒去菌柄，無菌水沖洗數(shù)次，移到超凈工作臺(tái)，用無菌紗布或脫脂棉、濾紙吸干外表水分。3.孢子的采集4.稀釋、接種〔接種環(huán)或注射針頭〕單孢別離法多孢別離法——孢子印法多孢別離法——鉤懸法多孢別離法——褶上涂抹法5.培養(yǎng)6.轉(zhuǎn)管25℃，恒溫培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)至1cm，轉(zhuǎn)管。培養(yǎng)7~10天。1.種菇的選擇和消毒；2.用手術(shù)刀將菌柄與菌蓋交界處的組織切成大米粒大小的小塊；3.接種將組織塊接到斜面中心略偏試管底部處；4.培養(yǎng)5.轉(zhuǎn)管二、組織別離法1.菇木的采集2.菇木的消毒并去掉樹皮3.將菇木切成大米粒大小的小塊4.將菇木小塊接到斜面中心略偏試管底部處；5.培養(yǎng)25℃，恒溫培養(yǎng)。6.轉(zhuǎn)管待菌絲長(zhǎng)至1cm，轉(zhuǎn)管。培養(yǎng)7~10天。三、菇木別離法土中菌絲別離：食用菌種類很多，許多土生的食用菌；孢子不易萌發(fā)。組織別離也不易成功，用土中菌絲別離獲得純種的方法，叫土中菌絲別離。

由于土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物，因此別離時(shí)必須盡可能避開這些微生物的干擾，盡可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接種，反復(fù)用無菌水沖洗，在培養(yǎng)基中參加一些抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物，如40微克／升的鏈霉素或金霉素。如發(fā)現(xiàn)感染細(xì)菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來，接種到木屑培養(yǎng)基中。因細(xì)菌沒有分解木質(zhì)素的能力，因此在木屑培養(yǎng)基中不易擴(kuò)展；只局限于接種處。待菌絲長(zhǎng)出感染區(qū)后，就可以再進(jìn)行擴(kuò)大提純了。子實(shí)體基局部離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實(shí)體基局部離出新菌絲的方法，叫子實(shí)體基局部離，以袋栽銀耳為例說明：從出耳早、無病蟲害的栽培室中；選擇生活力最強(qiáng)的幼耳5袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場(chǎng)所進(jìn)行后期培養(yǎng)，以增強(qiáng)菌絲體的生活力。經(jīng)培養(yǎng)7～10天后，待子實(shí)體直徑達(dá)4～5厘米時(shí)便可取回，作為別離的母體。再?gòu)闹泻Y選最理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實(shí)體，放置于0℃的冰箱或有敵敵畏的容器中過夜，以便殺死瓶中的害蟲。然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質(zhì)，連同接種工具、接種培養(yǎng)基等移進(jìn)無菌室。經(jīng)滅菌后，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，并進(jìn)行培養(yǎng)。待袋口露出白色菌絲時(shí)，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結(jié)體，迅速移入母種試管培養(yǎng)基的中央，輕輕地脫去接種針，塞上棉塞。為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管，以便從中選擇。別離后應(yīng)及時(shí)移入22℃—24℃恒溫箱或溫室中培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基內(nèi)水分較多，菌絲恢復(fù)要比耳木別離得快。經(jīng)2-3天后，別離物的邊緣就可看到白色菌絲。每天要至少觀察兩次，以便提純。觀察、提純方法與耳木別離法擔(dān)同。經(jīng)適溫培養(yǎng)10-15天后，當(dāng)接種塊扭結(jié)團(tuán)出現(xiàn)紅、黃色水珠時(shí)，即可擴(kuò)大原種。第五節(jié)

菌種質(zhì)量的鑒定和保藏〔1〕鏡檢；〔2〕PDA培養(yǎng)基試驗(yàn)；〔3〕高溫試驗(yàn)〔35℃半天〕；〔4〕菌絲生長(zhǎng)觀察〔速度、密度〕；〔5〕吃料觀察；〔6〕產(chǎn)量試驗(yàn)及子實(shí)體質(zhì)量觀察。一、菌種質(zhì)量的鑒定1.母種質(zhì)量的鑒定2.原種和栽培種的質(zhì)量要求〔1〕用轉(zhuǎn)管5次以內(nèi)的母種生產(chǎn)原種和栽培種；〔2〕室溫下3個(gè)月的菌令；〔舉例：老化菌種〕；〔3〕菌絲潔白、健壯、絨毛菌絲多；〔4〕無雜菌污染；〔5〕無黃水滲出。二、菌種的保藏1.傳代培養(yǎng)保藏法〔1〕斜面法——根本方法①菌種轉(zhuǎn)接到適宜斜面上〔最好用帶帽的螺旋試管〕；②適溫培養(yǎng)至菌體健壯；③用油紙包扎好棉塞局部，4℃冰箱保藏；④定期轉(zhuǎn)管。特點(diǎn)：①簡(jiǎn)單易行，能隨時(shí)觀察，適宜短期保藏的菌種；②保藏時(shí)間短，一般為2~4個(gè)月，需定期傳代培養(yǎng)，容易污染，菌種易退化。

〔2〕液體石蠟法長(zhǎng)好斜面的菌種→加無菌液體石蠟→蓋試管帽→直立4℃冰箱保藏。特點(diǎn)：①保藏時(shí)間一般為1~2年，不須經(jīng)常轉(zhuǎn)接；②缺點(diǎn)是需直立，占空間大，不變于攜帶。

2.冷凍保藏法

將菌種處于冷凍狀態(tài)，使其代謝作用停止，理論上新陳代謝停止是-130℃，可無限期保藏。低溫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，速凍冰晶小而減小對(duì)細(xì)胞的損傷；快速升溫，可減少對(duì)細(xì)胞的損傷?！?〕原理：〔2〕冷凍保護(hù)劑保護(hù)劑可提高存活率，如：甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、脫脂牛奶等。①液氮保藏法：-196℃

，需使用專用器具，適合專業(yè)保藏，理想的保藏方法；

②-70℃低溫冰箱保藏法

③-20℃~-30℃普通冰箱保藏法三、菌種的復(fù)壯復(fù)壯是從衰退的群體中找出少數(shù)尚無衰退的個(gè)體。1.淘汰已衰退的個(gè)體將斜面菌絲制成菌懸液→用注射器接種于平板中→適溫培養(yǎng)至菌絲萌發(fā)→挑選健壯菌絲轉(zhuǎn)接→經(jīng)試驗(yàn)符合原菌種形狀→用于生產(chǎn)2.定期重新別離菌種一般1~2年后重新別離一次，可采用組織別離法或菇木別離法一、組織別離法別離母種時(shí)，組織塊不萌發(fā)的原因1.消毒過頭2.燙死3.挫折4.污染5.種菇有病第六節(jié)

菌種制備過程中的幾個(gè)問題二、母種接原種時(shí)，母種不萌發(fā)的原因

1.消毒過頭2.燙死3.挫折4.污染5.母種老化接種塊沒有貼緊培養(yǎng)基2.培養(yǎng)基含水量太低pH不適宜4.培養(yǎng)基配方不合理5.恒溫器控制失靈三、制原種和栽培種時(shí)，接種塊不萌發(fā)后不吃料的原因四、菌種污染的原因1.雜菌出現(xiàn)在中下部或全瓶〔袋〕——滅菌不徹底2.瓶〔袋〕壁上某處出現(xiàn)雜菌——瓶〔袋〕有裂口3.接種塊上發(fā)生污染

——菌種本身帶菌或接種工具消毒不徹底4.瓶〔袋〕接種穴外表出現(xiàn)雜菌——接種操作不嚴(yán)第七節(jié)

菌種生產(chǎn)的季節(jié)安排一、母種的活化新購(gòu)置或冰箱保藏的菌種必須活化。所謂活化，是指將菌種重新轉(zhuǎn)接，在適宜的溫度下培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿斜面，即得到活化菌種一般需要10~15天。二、母種的擴(kuò)接

根據(jù)生產(chǎn)需要，按排接種時(shí)間和支數(shù)。

不同的食用菌從接種到滿管所需要的天數(shù)：