酶標(biāo)記物的制備課件

第三節(jié)酶標(biāo)記物的制備酶標(biāo)記物的制備一、酶制劑及其底物作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：(1)活性高

(2)性質(zhì)穩(wěn)定(3)專一性強(qiáng)(4)酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量(5)方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行(6)酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。酶標(biāo)記物的制備辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)HRP比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，PH5左右。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。酶標(biāo)記物的制備HRP酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)的過程：

HRP

DH2＋H2O2────→D＋2H2O供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD和TMB。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2,2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，靈敏度和穩(wěn)定性均好。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。酶標(biāo)記物的制備HRP常用底物底物產(chǎn)物性質(zhì)主要吸收峰波長（nm）ABTS綠色水溶性產(chǎn)物410、650OPD鄰苯二胺桔黃色水溶性產(chǎn)物492TMB四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)色水溶性產(chǎn)物加入硫酸或磷酸，產(chǎn)生黃色370、652450DAB3.3－二氨基聯(lián)苯胺不溶性棕色沉淀免疫組化Chloronaphthol產(chǎn)物顏色介于藍(lán)色-藍(lán)紫色，易于成像免疫印跡、免疫組化AEC棕紅色沉淀，容易成像多重染色的第二標(biāo)記酶標(biāo)記物的制備堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)，ALP:系小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉出來的一種磷酸酯的水解酶，由多個(gè)同功酶組成。小牛腸粘膜ALP分子量為100kDa，酶作用的最適pH為9.6；大腸桿菌ALP分子量為80kDa，最適pH為8.0。ALP作用底物較多，常用的酶底物有對(duì)硝基苯磷酸鹽(PNP)、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。ALP主要用作雙標(biāo)記染色，研究遞質(zhì)共存及酶免疫測(cè)定。ALP標(biāo)記抗體，一般采用戊二醛作交聯(lián)劑一步法，使酶和抗體蛋白的氨基分別與戊二醛的兩個(gè)醛基結(jié)合。酶標(biāo)記物的制備ALP常用底物底物產(chǎn)物性質(zhì)主要吸收峰波長（nm）pNPP對(duì)-硝基苯磷酸酯黃色產(chǎn)物----硝基酚405nm

NBT不溶性黑紫色沉淀免疫印跡其它：酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶酶標(biāo)記物的制備作為酶標(biāo)記對(duì)象的抗原與抗體要求：抗原要求純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。二、酶結(jié)合物的制備方法酶標(biāo)記物的制備制備方法要求：（1）技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好；（2）標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性；（3）酶標(biāo)記物穩(wěn)定，不形成聚合物。酶標(biāo)記物的制備方法原理酶標(biāo)記率直接結(jié)合法過碘酸鹽氧化法過碘酸鈉氧化酶分子表面多糖羥基成醛基，與抗體/抗原中氨基反應(yīng)，形成Schiffs堿。70%交聯(lián)法戊二醛一步法酶和抗體/抗原同時(shí)加入戊二醛溶液中，戊二醛兩醛基分別與酶及抗體/抗原上氨基反應(yīng)，生成Schiffs堿1～5%戊二醛二步法酶和抗體/抗原先后分別加入戊二醛溶液中5～25%馬來酰亞胺法雙功能交聯(lián)劑PDM通過酶和抗體/抗原中巰基將兩者偶聯(lián)起來高異雙功能基團(tuán)交聯(lián)法異雙功能基團(tuán)交聯(lián)劑HECCM分別通過其羥琥珀酰亞胺基和馬來酰亞胺基與酶和抗體/抗原上游離氨基和巰基結(jié)合85%幾種常用標(biāo)記方法比較酶標(biāo)記物的制備（一）過碘酸鹽氧化法原理：HRP是一種糖蛋白,糖鏈部分無活性，其己糖鄰位-0H可被堿性過碘酸鹽氧化成醛基，再與抗體蛋白中游離-NH2形成schiff堿；酶與抗體結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉(NaHB4）還原成穩(wěn)定的HRP-IgG偶聯(lián)物。所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70％的HRP和IgG結(jié)合，99％的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重

大損失，是目前最常用的方法。酶標(biāo)記物的制備1、HRP標(biāo)記腹水單抗過碘酸鈉氧化法，HRP直接標(biāo)記腹水中的單抗

1、5mgHRP溶解于0.5ml0.1MNaHCO3中；2、加0.5ml10mMNaIO4，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2h；

3、加0.75ml0.1MNa2CO3，混勻；4、加0.75ml小鼠腹水單抗，混勻；

5、加SephadexG25干粉0.5g，混勻，蓋緊，室溫作用3h；6、用少許PBS將交聯(lián)物轉(zhuǎn)移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中；7、用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出；8、收集洗出液，加1/20V新鮮配制的5mg/mlNaBH4溶液，混勻，室溫作用30min；9、再加3/20VNaBH4溶液，混勻，室溫作用1h；酶標(biāo)記物的制備

10、將交聯(lián)物過SephdexG200（2.6×100cm）層析純化，分管收集第一峰。Fig2-1.GelfiltrationofthereactionmixtureofHRPconjugatedtomAb13A4onaSephadexG200column（2.6cm×100cm）,equilibratedwithPBS,atarateof0.15ml/minandatube/15min.酶標(biāo)記物的制備（二）戊二醛交聯(lián)法原理：戊二醛是一種常用的同型雙功能交聯(lián)劑，通過它的兩個(gè)醛基分別與HRP和抗體蛋白的氨基結(jié)合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白結(jié)合物。戊二醛一步法是將酶和待標(biāo)記抗體混合，同時(shí)加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。戊二醛二步法是將酶先與戊二醛作用，形成酶-戊二醛結(jié)合物，結(jié)過透析或?qū)游龀ノ唇Y(jié)合的戊二醛，然后再與抗體結(jié)合。酶標(biāo)記物的制備HRP標(biāo)記多抗1、取10mgHRP溶于0.2mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB將25%戊二醛稀釋為1.25%)，室溫（20℃左右）反應(yīng)結(jié)合18h。2、用0.15mol/LNaCl平衡過的SephadexG-50凝膠柱洗脫，除去游離的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析過夜。3、將5mg抗體IgG溶于1mL0.15mol/LNaCl，再與醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。酶標(biāo)記物的制備4、加入0.1mL1mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液（調(diào)節(jié)pH至9.0～9.6），4℃，電磁攪拌下結(jié)合24h。5、加入0.1mL0.2mol/L賴氨酸（0.29g溶于10mL蒸餾水），4℃放置2h，以封閉殘留的醛基，終止反應(yīng)。6、裝入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2PBS，4℃透析過夜，或通過SephadexG-200凝膠柱層析，用PBS洗脫，收集第1峰洗脫液。本法標(biāo)記步驟比較簡單，重復(fù)性好。缺點(diǎn)：酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。酶標(biāo)記物的制備三、標(biāo)記抗體質(zhì)量判定（2）定量和克分子比值測(cè)定：分光光度計(jì)測(cè)定(光程1cm)酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×

0.3)×0.62(過碘酸鹽)IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62(戊二醛)

酶量(mg/ml)IgG量(mg/ml)酶量HRP/IgG(摩爾比)＝────────÷───────＝───×4

40,000160,000

IgG量標(biāo)記率=OD403nm/OD280nm

酶標(biāo)記物的制備用于ELISA酶標(biāo)抗體的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)評(píng)價(jià)最好好一般酶結(jié)合量(mg/ml)≥1.0≥0.50.4酶結(jié)合率(%