第四章 DNA的突變損傷和修復(fù)

Chapter4.DNAdamage,repair，mutation第一節(jié)：突變〔mutation)一、突變的主要類型突變是DNA堿基序列水平上的永久的、可遺傳的改變。堿基序列的變化可以分為下面幾種類型：堿基替換〔basesubstitution〕，即DNA分子中一個(gè)堿基被另一個(gè)堿基替代；插入〔insertion〕，涉及一個(gè)或多個(gè)堿基插入到DNA序列中；缺失〔deletion〕，涉及DNA序列上一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失；重復(fù)〔duplication〕，一段堿基序列發(fā)生一次重復(fù)；倒位〔inversion〕，一段堿基序列發(fā)生倒轉(zhuǎn)，但仍保存在原來的位置上；易位〔translocation〕，一段堿基序列從原來的位置移出，并插入到基因組的另一位置。1.堿基替換堿基替換又稱為點(diǎn)突變〔pointmutation〕，是一種最簡單的突變。堿基替換可以分為轉(zhuǎn)換〔transition〕和顛換〔transversion〕兩種類型。轉(zhuǎn)換是指嘌呤與嘌呤之間，或嘧啶與嘧啶之間的替換；顛換是指嘌呤與嘧啶之間的替換。轉(zhuǎn)換：嘌呤與嘌呤之間，嘧啶與嘧啶之間的互換

AG TC顛換：嘌呤與嘧啶之間發(fā)生互換

ATorCTAorG

GTorCCAorG

根據(jù)堿基替代對多肽鏈中氨基酸順序的影響，點(diǎn)突變又可以分為同義突變、錯義突變和無義突變?nèi)N類型。有時(shí)DNA的一個(gè)堿基對的改變并不會影響基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這是因?yàn)楦淖兒蟮拿艽a子和改變前的密碼子是簡并密碼子，它們編碼同一種氨基酸，這種基因突變稱為同義突變〔synonymousmutation)。由于堿基對的改變而使決定某一氨基酸的密碼子變?yōu)闆Q定另一種氨基酸的密碼子的基因突變叫錯義突變〔missensemutation〕?；蛲蛔冇锌赡苁顾幋a的蛋白質(zhì)局部或完全失活，例如人血紅蛋白β鏈的基因如果將決定第6位氨基酸的密碼子由GAG〔谷氨酸〕變?yōu)镚TG(纈氨酸)，從而引起鐮刀形細(xì)胞貧血病。fig.11.2sicklecelldisease有一些錯義突變造成的氨基酸替代并不影響蛋白質(zhì)的功能，我們就稱之為中性突變。例如密碼子AGG→AAG，導(dǎo)致了Lys取代了Arg，這兩種氨基酸都是堿性氨基酸，性質(zhì)十分相似，所以蛋白的功能并不發(fā)生重大的改變。中性突變連同同義突變一起被稱為沉默突變〔silentmutation〕。由于某個(gè)堿基替代使決定某一氨基酸的密碼子變成一個(gè)終止密碼子的基因突變叫無義突變〔nonsensemutation〕。其中密碼子改變?yōu)閁AG的無義突變又叫琥珀突變，密碼子改變成UAA的無義突變又叫赭石突變。無義突變使多肽鏈的合成提前終止，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)，這樣的蛋白質(zhì)常常是沒有活性的。突變也可以把終止密碼子轉(zhuǎn)變成編碼某一氨基酸的有義密碼子，造成終止信號的通讀〔readthrough〕，結(jié)果是多肽鏈的C末端添加了一段氨基酸序列。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)，C末端延伸一段短的氨基酸序列，并不影響它們的功能，但是過長的延伸會影響蛋白質(zhì)的折疊，降低蛋白質(zhì)的活性。2.

Deletions,InsertionsandFrameshiftmutations基因的編碼序列中插入或者缺失一個(gè)或兩個(gè)堿基，會使DNA的閱讀框架發(fā)生改變，導(dǎo)致插入或缺失部位之后的所有密碼子都跟著發(fā)生變化，結(jié)果產(chǎn)生一種截短的或異常的多肽鏈，這種突變稱為移碼突變〔frameshiftmutations〕。移碼突變常常完全破壞了編碼蛋白質(zhì)的功能，除非移碼突變發(fā)生在靠近讀碼框的遠(yuǎn)端的地方。Frameshiftmutation

5'AUGUGGGGACCCAAGGGUAGCCCC...3'(wild-type)mettrpglyprolysglyserpro...5'AUGUGGGGGACCCAAGGGUAGCCCC..3'(mutant)mettrpglythrglnglystopTwochangesinpolypeptidesarepossible:(1)everyaminoaciddownstreamofthemutationischanged,(2)atruncated(shortened)proteinisproduced.然而，一次插入或者缺失三個(gè)堿基會添加或者刪除一個(gè)完整的密碼子，閱讀框又得到恢復(fù)。這時(shí)，除了添加或缺失一個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)的其他局部并未發(fā)生變化。如果添加〔或缺失〕的氨基酸不在蛋白質(zhì)的功能區(qū)，仍能產(chǎn)生功能蛋白。3.DNA重排DNA重排包括缺失、倒位、易位和重復(fù)。基因組中相似序列之間的配對，以及隨后發(fā)生的重組可以造成DNA的重排。如圖，同一DNA分子的兩個(gè)同向重復(fù)序列之間的配對和重組將使兩個(gè)重復(fù)序列之間的局部形成一個(gè)獨(dú)立的環(huán)，從原來的DNA分子上釋放出來。原來的DNA分子那么產(chǎn)生相應(yīng)的缺失。圖表示同一DNA分子上的兩個(gè)反向重復(fù)序列發(fā)生配對形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。配對后的重組將導(dǎo)致反向重復(fù)序列之間的局部發(fā)生倒位。大腸桿菌染色體含有7個(gè)拷貝的rRNA基因。有一些大腸桿菌菌株，染色體上兩個(gè)rRNA操縱子之間的序列發(fā)生了倒位。這些菌株能夠存活，但生長速度比正常的菌株要慢一些。二、突變的產(chǎn)生

1．自發(fā)突變〔1〕復(fù)制過失可以引起自發(fā)突變〔spontaneousmutation〕DNA聚合酶在DNA復(fù)制過程中偶爾會出現(xiàn)過失，將錯誤的堿基插入到DNA分子中，引發(fā)突變。另外，堿基的互變異構(gòu)有時(shí)也會導(dǎo)致突變的發(fā)生。DNA分子中的堿基都存在兩種互變異構(gòu)體，它們處于動態(tài)平衡中，所以每一種堿基都可以從一種異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N異構(gòu)體。DNA復(fù)制時(shí)，堿基配對的性質(zhì)由于堿基互變異構(gòu)化而發(fā)生的改變也能產(chǎn)生突變。圖表示偶爾在復(fù)制叉到達(dá)的關(guān)鍵時(shí)刻，模板上的G從酮式變?yōu)橄〈际剑率箟A基的配對性質(zhì)發(fā)生了變化，與T而不是與C配對。DNA再復(fù)制一次產(chǎn)生的兩個(gè)子代雙螺旋中的一個(gè)將帶有突變，罕見的互變異構(gòu)體會轉(zhuǎn)變成其常見形式，配對性質(zhì)有恢復(fù)到正常。由于正常堿基形成異構(gòu)體的幾率很低，所以自發(fā)突變的頻率也很低，一般為10－6～10－10。如果某一堿基類似物能以較高的頻率產(chǎn)生異構(gòu)體，當(dāng)摻入DNA分子后，就能提高突變率。TautomericshiftscanbeasourceofrarespontaneousmutationDuringthenextroundofDNAreplication,thetransitionmutationbecomes“fixed〞intheDNA.并非所有的復(fù)制錯誤都是點(diǎn)突變，異常的復(fù)制也可以造成插入或缺失突變。當(dāng)復(fù)制叉遇到串聯(lián)重復(fù)序列時(shí)模板鏈與新生鏈之間有時(shí)會發(fā)生相對移動，導(dǎo)致局部模板鏈被重復(fù)復(fù)制或者被遺漏，其結(jié)果是新生鏈多了或少了一些重復(fù)單位。復(fù)制滑移〔strandslippage〕是微衛(wèi)星〔microsatellite〕產(chǎn)生的主要原因。(a)Normalreplication.

(b)Backwardslippage,resultingintheinsertionmutation.

(c)Forwardslippage,resultinginthedeletionmutation.

微衛(wèi)星是一種短串連重復(fù)DNA。典型的微衛(wèi)星是以1，2，3或4bp長的序列為單位，重復(fù)10～20次形成的。人類微衛(wèi)星中，最常見的類型是二核苷酸重復(fù)序列，在整個(gè)人類基因組中約140000拷貝。比方，人類基因組具有CA重復(fù)的微衛(wèi)星，CACACACACACACAC，占基因組0.25％，共8Mb。發(fā)生在短重復(fù)序列處的鏈的滑移也可能與人類的三核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增疾病〔trinucleotiderepeatexpansiondisease〕的發(fā)生有關(guān)。例如，人類HD基因含有串聯(lián)重復(fù)6～35次的5’-CAG-3’，編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物中的多聚谷胺酰胺。在亨廷頓氏病〔Huntington’disease〕中，這些重復(fù)序列擴(kuò)增至36～121個(gè)拷貝，增加了多聚谷胺酰胺的長度，造成蛋白質(zhì)功能障礙。一些與智力缺陷有關(guān)的疾病與基因前導(dǎo)區(qū)的三核苷酸擴(kuò)增引起的染色體脆性位點(diǎn)〔fragilesite〕有關(guān)。(2)堿基的脫氨作用引起的自發(fā)突變在正常的生理?xiàng)l件下，腺嘌呤、鳥嘌呤、尤其是胞嘧啶可以自發(fā)地發(fā)生脫氨作用〔deamination〕，脫去嘌呤環(huán)或嘧啶環(huán)上的氨基。胞嘧啶脫氨產(chǎn)生尿嘧啶，因此復(fù)制時(shí)在新生鏈對應(yīng)的位點(diǎn)上插入的是腺嘌呤而不是鳥嘌呤。腺嘌呤自發(fā)脫氨轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤，次黃嘌呤優(yōu)先與胞嘧啶配對，而不是與胸腺嘧啶配對。因此，腺嘌呤和胞嘧啶的脫氨作用可以造成突變。鳥嘌呤脫氨后變成了黃嘌呤〔xanthine〕，由于黃嘌呤仍與胞嘧啶配對，只是它們之間只形成兩個(gè)氫鍵，因此鳥嘌呤的脫氨作用并不能引起突變。DeaminationofCyieldsUwhichbasepairswithAResultsinC-GtoT-AtransitionThisoccursspontaneouslyDeamination2.Mutationsareproducedbymutagens某些物理或化學(xué)因素可以提高突變率，這些能夠?qū)е峦蛔兊奈锢砘蚧瘜W(xué)因素就稱為誘變劑〔mutagen〕。誘變劑會對DNA分子造成損傷。如果損傷在DNA復(fù)制之前還沒有被體內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)所修復(fù)，在DNA復(fù)制過程中，當(dāng)復(fù)制叉抵達(dá)損傷部位時(shí)，常常發(fā)生復(fù)制錯誤，從而引起誘變。不同的誘變劑以不同的方式對DNA分子產(chǎn)生損傷，因而誘導(dǎo)突變的方式可能也不同。對DNA造成損傷的因素并不一定都是誘變劑，比方造成DNA斷裂的斷裂劑。這種類型的損傷可阻遏復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(1)物理誘變劑

紫外線引起相鄰的嘧啶堿基產(chǎn)生嘧啶二聚體X-射線和γ-射線是電離輻射，它們作用于水分子以及其他的細(xì)胞內(nèi)分子產(chǎn)生離子和自由基，尤其是羥自由基〔hydroxylradical〕。具有高度反響活性的自由基會對DNA分子產(chǎn)生廣泛的損傷。X-射線和γ-射線也可以直接作用于DNA，對DNA產(chǎn)生損傷。在分子生物學(xué)開展的早期，X－射線經(jīng)常被用來在實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生突變。X－射線傾向于產(chǎn)生多種突變，并且常常造成DNA重排，例如缺失、倒轉(zhuǎn)和移位。加熱可以促進(jìn)堿基和戊糖之間N-糖苷鍵的水解，結(jié)果導(dǎo)致DNA分子上出現(xiàn)AP〔apurinic/apyrimidinic,無嘌呤/無嘧啶〕位點(diǎn)，其中嘌呤更容易從DNA分子上脫落。AP位點(diǎn)處的糖－磷酸基團(tuán)不穩(wěn)定，很快被降解，在雙鏈DNA分子上留下一個(gè)缺口。雙鏈DNA分子上的缺口一般沒有誘變作用，因?yàn)檫@種損傷可以被有效修復(fù)。事實(shí)上，在人的一個(gè)細(xì)胞中，每一天會形成10000個(gè)AP位點(diǎn)。但是，在某些情況下，缺口可以產(chǎn)生突變，比方大腸桿菌細(xì)胞中的SOS反響被激活時(shí)。(2)化學(xué)誘變劑

堿基類似物〔baseanalog〕指化學(xué)結(jié)構(gòu)與核酸分子中的正常堿基類似的化合物，在DNA正常合成過程中，堿基類似物可以與模板上的堿基配對摻入到DNA分子中，而不被DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性所切除。如果是單純的堿基替代并不引發(fā)突變，因?yàn)樵谙乱惠咲NA復(fù)制時(shí)又可以產(chǎn)生正常的DNA分子。然而，堿基類似物能以更高的頻率發(fā)生酮式和稀醇式的互變異構(gòu)，或者形成兩種形式的氫鍵，這就使堿基類似物具有誘變作用〔mutagenic〕。

堿基類似物Base-analoguemutagens的誘變作用

最常被應(yīng)用堿基類似物是5-溴尿嘧啶〔5－bromouracil,5-BU或BU〕和2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2-AP)。通常情況下5-溴尿嘧啶以酮式結(jié)構(gòu)存在，是胸腺嘧啶(T)的結(jié)構(gòu)類似物，能與A配對。但它有時(shí)能以稀醇式結(jié)構(gòu)存在，與G配對。在DNA復(fù)制時(shí)，BU以通常的酮式結(jié)構(gòu)取代T與A配對摻入到DNA分子中。在下一輪復(fù)制中，酮式結(jié)構(gòu)可以變成稀醇式結(jié)構(gòu)，與G配對。再經(jīng)過一輪的復(fù)制，G與C配對，引起TA至CG的轉(zhuǎn)換。在DNA復(fù)制時(shí)BU也可以取代C與G配對，產(chǎn)生GC至AT的轉(zhuǎn)換，但這種能力較弱。不管哪種情況，BU摻入到DNA分子后，必須經(jīng)過兩輪復(fù)制才能產(chǎn)生穩(wěn)定的可遺傳的突變。AGCTTCCTATCGAAGGATAGCTBCCTATCGAAGGATBaseanalogincorporationAGCTBCCTATCGAGGGATAGCTTCCTATCGAAGGAT1stroundofreplicationAGCTBCCTATCGAAGGATAGCTCCCTATCGAGGGAT2ndroundofreplicationA·T

G·Ctransition2-氨基嘌呤是腺嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物，它能代替A進(jìn)入DNA分子中與T配對有兩個(gè)氫鍵，結(jié)合的程度較牢固；它也能與C形成只有一個(gè)氫鍵的堿基對，結(jié)合得較弱。隨后經(jīng)DNA復(fù)制，C與G配對完成AT至GC的轉(zhuǎn)換，且這種轉(zhuǎn)換多是單方向的，因?yàn)?-氨基嘌呤較難代替G而與C配對。

脫氨劑(Deaminationagents〕的誘變作用許多化學(xué)誘變劑能以不同的方式修飾DNA分子的堿基，改變其配對性質(zhì)而引起突變。脫氨劑〔deaminationagent〕可以除去堿基上的氨基，改變其配對性質(zhì)，造成堿基轉(zhuǎn)換突變。脫氨作用也可以自發(fā)地發(fā)生，但是一些化學(xué)物質(zhì)，例如亞硝酸〔nitrousacid〕，可以促進(jìn)腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤脫氨作用的發(fā)生。腺嘌呤脫氨后變成次黃嘌呤〔hypoxanthine〕，次黃嘌呤與C配對而不是與T配對，胞嘧啶脫氨后變成尿嘧啶與A配對而不是與C配對。因此，腺嘌呤和胞嘧啶的脫氨作用可以造成突變。烷化劑是一類能夠向堿基上添加烷基基團(tuán)的誘變劑。烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊。烷化劑(Alkylating〕的誘變作用嵌入劑〔intercalatingagents〕誘變作用吖啶橙〔acridineorange〕、原黃素(proflavine)和溴化乙啶〔ethidiumbromide〕等吖啶類染料有效的移碼突變誘變劑。吖啶類化合物是一種平面三環(huán)分子，其大小和形狀與一個(gè)嘌呤-嘧啶堿基對相似，因此能夠插入DNA分子中兩個(gè)相鄰的堿基對之間，使得原來相鄰的堿基對分開一定的距離，致使DNA在復(fù)制時(shí)增加或缺失一個(gè)堿基，造成移碼突變。活性氧分子氧〔O2〕對DNA分子不會造成損傷，但是活性氧會對DNA分子產(chǎn)生廣泛的損傷?；钚匝醢ǔ趸镒杂苫睸uperoxide〕、羥自由基〔hydroxylradical〕、過氧化氫〔hydrogenperoxide〕等。與分子氧相比，活性氧攜帶了更多的電子。細(xì)胞內(nèi)的活性氧既可以由細(xì)胞內(nèi)的正常代謝途徑產(chǎn)生，也可以由環(huán)境因子誘導(dǎo)產(chǎn)生。這些自由基可在許多位點(diǎn)上攻擊DNA，產(chǎn)生一系列氧化產(chǎn)物。在眾多氧化損傷中，鳥嘌呤8位碳原子的氧化最為常見，其氧化產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤(8-hydroxy-guanine)較為穩(wěn)定，易于檢測，被視為DNA氧化損傷的標(biāo)志物。8-羥基鳥嘌呤優(yōu)先與A配對，在DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生G:C到T:A的顛換。

“O2-〞 hyperoxide“H2O2〞 Peroxide“OH?〞 hydroxyl三、正向突變、回復(fù)突變與突變的校正目前為止，我們所討論的突變屬于正向突變〔forwardmutation〕，也就是改變了野生型性狀的突變。相反的過程也可以發(fā)生，這種使突變型性狀恢復(fù)到野生型性狀的突變就稱為回復(fù)突變〔reversemutation〕?；貜?fù)突變可以自發(fā)地發(fā)生，也可以用誘變劑處理增加其頻率?；貜?fù)突變產(chǎn)生的機(jī)制十分復(fù)雜，最簡單的情形是第二次突變與第一次突變發(fā)生在同一位點(diǎn)，并且恢復(fù)了野生型序列這是真正的回復(fù)突變。然而，真正的回復(fù)突變很少發(fā)生，大多數(shù)回復(fù)突變都發(fā)生在另一位點(diǎn)。因此，這樣的第二次突變并未恢復(fù)野生型的堿基序列，只是其表型被抑制了。第二點(diǎn)突變可以發(fā)生在同一基因之中，也可以發(fā)生在不同的基因之中，前者稱為基因內(nèi)抑制，后者稱為基因間抑制。在這一章，我們僅考察一下基因內(nèi)抑制形成的機(jī)制。錯義突變所造成的表型性狀的改變可能是因?yàn)橥蛔冇绊懙搅说鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的喪失。假設(shè)，一種蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成完全取決于多肽鏈上兩個(gè)特定氨基酸殘基之間的靜電吸引作用。如果突變導(dǎo)致其中一個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基被一帶負(fù)電荷的氨基酸殘基所取代，蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)就不能正確折疊。但是，如果第二次突變使另一帶負(fù)電荷的氨基酸殘基又被一帶負(fù)電荷的氨基酸殘基取代，蛋白質(zhì)就會形成正確的構(gòu)象。1.基因內(nèi)抑制

圖表示了另一種更為復(fù)雜的基因內(nèi)抑制。在這里，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由6個(gè)氨基酸殘基之間的疏水作用維持的。正向突變使其中一個(gè)側(cè)鏈較小的氨基酸殘基，被一個(gè)側(cè)鏈較大的氨基酸殘基所取代。而第二位點(diǎn)的回復(fù)突變使原來與丙氨酸相互作用的較大的氨基酸殘基變?yōu)檩^小的氨基酸殘基，恢復(fù)了疏水作用，因而恢復(fù)了蛋白質(zhì)分子的功能。

對第2位點(diǎn)氨基酸取代的抑制效應(yīng)進(jìn)行分析有助于揭示蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。如果氨基酸A被X取代所產(chǎn)生的突變型效應(yīng)被發(fā)生在另一位點(diǎn)的氨基酸取代〔比方氨基酸B被Y取代〕所抑制，A和B兩個(gè)氨基酸在蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)中彼此接近，或者位于兩個(gè)蛋白質(zhì)上兩個(gè)相互作用的區(qū)域。移碼突變的回復(fù)突變通常發(fā)生在同一基因的另一個(gè)位點(diǎn)上，并且回復(fù)突變位點(diǎn)靠近原初的突變位點(diǎn)，只有這樣兩個(gè)突變位點(diǎn)之間才會有很少的氨基酸發(fā)生改變。兩個(gè)突變位點(diǎn)之間的氨基酸序列發(fā)生改變不會對蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生顯著影響。2．基因間抑制我們已經(jīng)知道，編碼一種氨基酸的密碼子變成終止密碼子稱為無義突變，無義突變產(chǎn)生一種截短的、通常無功能的蛋白質(zhì)。無義突變可以被另一基因上的突變所抑制。無義突變的抑制突變通常是一個(gè)tRNA基因突變，導(dǎo)致其反密碼子發(fā)生改變，結(jié)果產(chǎn)生一種能夠識別終止密碼子的tRNA。在圖中，野生型基因中一個(gè)編碼酪氨酸的密碼子UAC突變成一個(gè)終止密碼子UAG。突變基因編碼一條無活性的蛋白質(zhì)片段。細(xì)胞內(nèi)無意突變的抑制突變發(fā)生在亮氨酰tRNA基因內(nèi)，突變使tRNALeu的反密碼子由3’-AAC-5’轉(zhuǎn)變成3’-AUC-5’。突變的tRNA把終止密碼子UAG讀成亮氨酸的密碼子。

這種突變的tRNA稱為抑制子tRNA〔suppressortRNA〕。一般把終止密碼子UAG稱為琥珀型〔amber〕，UAA為赭石型(ochre)，UGA為乳白型(opal)。琥珀型抑制子為識別UAG的突變型tRNA。赭石型抑制子反密碼子為AUU，由于反密碼子和密碼子識別過程中的擺動原理，赭石型抑制tRNA可以識別UAA和UAG兩種反密碼子。乳白型反密碼子很少發(fā)現(xiàn)。抑制tRNA的產(chǎn)生并不會影響讀碼框中有義密碼子的識別。對于一種密碼子細(xì)胞往往有多個(gè)拷貝的tRNA基因，即使其中一個(gè)拷貝發(fā)生了突變，也不會影響到對密碼子的識別。所以，抑制突變至少在微生物中相當(dāng)普遍，人們在細(xì)菌的谷胺酰胺、亮氨酸、絲氨酸、酪氨酸和色氨酸t(yī)RNA基因中發(fā)現(xiàn)了抑制突變。由抑制tRNA插入的氨基酸可能就是原來的氨基酸，這時(shí)蛋白質(zhì)的功能得到了完全的恢復(fù)。或者，抑制tRNA在突變位點(diǎn)插入了另外一種氨基酸，使得突變基因產(chǎn)生了一個(gè)有局部活性的蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)合成過程中，終止密碼子由釋放因子識別。這樣，抑制tRNA和釋放因子對終止密碼子的識別存在競爭。因此，抑制作用不是完全的，抑制效率通常是10％～40％。這樣的抑制效率可以為細(xì)胞足夠的功能蛋白。然而，抑制tRNA也能識別未突變基因的終止密碼子，造成通讀，產(chǎn)生延長的多肽鏈。攜帶抑制突變的細(xì)胞生長的速度比正常的細(xì)胞要慢也就缺乏為奇了。事實(shí)上，只有細(xì)菌和低等的真核生物〔例如，酵母，roundworms〕能夠容忍抑制突變。在昆蟲和哺乳動物中，抑制突變是致死的。四、突變的熱點(diǎn)突變可以發(fā)生在基因組中的任一位點(diǎn)。但是在基因組中，也存在一些位點(diǎn)，這些位點(diǎn)發(fā)生突變的幾率比隨機(jī)分布所估計(jì)的要高出許多，可能是預(yù)期的10倍或100倍，這些位點(diǎn)被稱為突變的熱點(diǎn)〔hotspot〕，發(fā)生在熱點(diǎn)上的突變常常是相同的。

大多數(shù)熱點(diǎn)是DNA分子中的5－甲基胞嘧啶位點(diǎn)。5－甲基胞嘧啶是DNA合成后，胞嘧啶被修飾后形成的，在DNA分子中與鳥嘌呤正確配對。然而，5－甲基胞嘧啶常常發(fā)生自發(fā)脫氨形成胸腺嘧啶，導(dǎo)致G-T對的產(chǎn)生，在雙鏈DNA分子中產(chǎn)生了一個(gè)錯配。當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，在一個(gè)子代DNA分子中，A-T對就取代了G-C對，導(dǎo)致突變的發(fā)生。

突變熱點(diǎn)的形成還有其他原因。如前所述，短的串聯(lián)重復(fù)序列在DNA復(fù)制時(shí)會發(fā)生鏈的滑移，造成重復(fù)單位的插入與缺失。因此，短的串聯(lián)重復(fù)序列也是突變的熱點(diǎn)。例如，大腸桿菌lacI基因中有三個(gè)連續(xù)的CTGG序列，很容易產(chǎn)生一個(gè)CTGG序列的插入突變或缺失突變。一系列物理或化學(xué)因素可以對DNA造成化學(xué)損傷。這些因素包括化學(xué)誘變劑、輻射以及DNA分子自發(fā)的化學(xué)反響等。有些類型的DNA損傷，如胸腺嘧啶二聚體或DNA骨架的斷裂，使得DNA不能再作為復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。第二節(jié)DNA的損傷和修復(fù)另一些損傷產(chǎn)生了改變了的堿基，它們不會阻止復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，但是可引起錯配，在下一輪復(fù)制之后導(dǎo)致DNA序列的永久改變。例如，胞嘧啶通過脫氨作用轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，產(chǎn)生U∶G錯配，在下一輪復(fù)制之后，一條子代DNA分子上的C∶

G被

T∶A所取代。細(xì)胞在進(jìn)化過程中，形成了多種修復(fù)機(jī)制，以保證在損傷阻遏復(fù)制或者產(chǎn)生突變之前就識別并修復(fù)損傷。

一、光復(fù)活〔Photoreactivation〕在可見光存在的情況下，DNA光解酶〔DNAphotolyase〕把環(huán)丁烷嘧啶二聚體分解為單體。DNA光解酶,又稱光復(fù)活酶〔photoreactivatingenzyme〕。光解酶在暗中結(jié)合到環(huán)丁烷二聚體上，吸收300～350nm的光后被激活，裂解二聚體后與DNA分子脫離。由于這種修復(fù)作用只在可見光下才可發(fā)生，所以這種修復(fù)機(jī)制稱為光復(fù)活。〔6－4〕光產(chǎn)物光解酶受光激活后，可以修復(fù)〔6－4〕損傷。光復(fù)活是一種廣為存在的DNA修復(fù)機(jī)制，在很多細(xì)菌和一些真核生物〔包括某些脊椎動物〕中都存在，但是在人類和有胎盤的哺乳動物中沒有這種修復(fù)機(jī)制。Fig14-21.Photoreactivationcleavespyrimidinedimers.NoDNAsynthesis350-500nmphotolyaseBindtodimerindarkbutlackenergytoremovecrosslink二、烷基的轉(zhuǎn)移

一些酶可將烷基從核苷酸轉(zhuǎn)移到自身的多肽鏈上，例如，在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有一種O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，能直接將DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上而修復(fù)損傷的DNA。O6-methylguanineDNAmethyltransferaseNNNNH2NO-CH3RNNNNH2NORactiveEnz.Cys-SHinactiveEnz.Cys-S-CH3O6-methylguaninenucleotideguaninenucleotideHH大腸桿菌的Ada〔adaptationtoalkylation〕蛋白可以通過兩個(gè)活性中心去除DNA分子上的甲基基團(tuán)。Ada蛋白的兩個(gè)活性中心分別位于多肽鏈的N-末端和C-末端。大腸桿菌的Ada〔adaptationtoalkylation〕蛋白可以通過兩個(gè)活性中心去除DNA分子上的甲基基團(tuán)。Ada蛋白的兩個(gè)活性中心分別位于多肽鏈的N-末端和C-末端。DNA光解酶和烷基轉(zhuǎn)移酶直接作用于DNA的損傷部位，把受到損傷的核苷酸恢復(fù)到原初的狀態(tài)，因此上述兩種修復(fù)機(jī)制又稱直接修復(fù)〔directrepair〕。核苷酸切除修復(fù)(nucleotideexcisionrepair,NER)需要移去一段包括損傷在內(nèi)的核苷酸序列，然后再通過DNA合成把余下的單鏈缺口填補(bǔ)上。它可以修復(fù)一系列損傷，包括環(huán)丁烷二聚體、6－4光產(chǎn)物和鏈間交聯(lián)等引起的DNA變形〔majordistortion〕。三、核苷酸切除修復(fù)當(dāng)正在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶遇到DNA損傷時(shí)，RNA聚合酶的移動受阻，RNA合成終止。這時(shí)，細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)將優(yōu)先修復(fù)模板鏈上的損傷。在細(xì)菌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄修復(fù)耦聯(lián)因子〔transcription-repaircouplingfactor,TRCF〕檢測到受阻的RNA聚合酶后，指導(dǎo)UvrAB與受阻位點(diǎn)結(jié)合，啟動切除修復(fù)。轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)修復(fù)的意義在于它將修復(fù)酶集中于正在被活潑轉(zhuǎn)錄的基因上。在真核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)修復(fù)尤其重要，因?yàn)檎婧松锘蚪M的編碼區(qū)相對稀少，距離較遠(yuǎn)。真核細(xì)胞實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄修復(fù)耦聯(lián)的關(guān)鍵組分是通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIH。TFIIH具有解旋酶活性，在轉(zhuǎn)錄起始的時(shí)候解開DNA雙鏈。在轉(zhuǎn)錄的過程中，TFIIH能夠檢測到DNA分子由于化學(xué)損傷產(chǎn)生的變形。當(dāng)TFIIH遇到DNA損傷時(shí)，會募集切除修復(fù)系統(tǒng)，切斷解鏈區(qū)，釋放出受到損傷的區(qū)段。DNA聚合酶修復(fù)單鏈缺口，轉(zhuǎn)錄得以重新開始。

四、堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)是去除DNA分子中受損堿基的一種主要方法。DNA糖基化酶〔glycosylases〕能夠切斷脫氨堿基、甲基化堿基和氧化堿基等非正常堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵，在DNA上產(chǎn)生一個(gè)無嘌呤〔apurinic〕或無嘧啶〔apyrimidinic〕位點(diǎn)〔AP位點(diǎn)〕。細(xì)胞胞內(nèi)的AP核酸內(nèi)切酶，附著在AP位點(diǎn)上，并在AP位點(diǎn)的5’-端切斷磷酸二酯鍵，形成一個(gè)游離的3’－OH末端。DNA聚合酶I利用其5’-3’外切酶活性切去AP位點(diǎn)以及其下游的一段核苷酸序列，同時(shí)延伸3’-OH末端填補(bǔ)缺口。最后的切口由DNA連接酶封閉。不同的受損堿基由專一性的DNA糖基化酶負(fù)責(zé)切除。胞嘧啶脫氨產(chǎn)生的尿嘧啶由尿嘧啶-N-糖基化酶〔uracil-N-glycosylase〕從DNA分子上去除。Fig14-18.dealingwithoxidizedguanine.Preventincorporationofpreformed8-oxoGintoDNA.MutT,MutM,MutY五、錯配修復(fù)〔mismatchrepair〕DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性可將錯誤摻入的核苷酸去除。聚合酶的這種校正功能將DNA復(fù)制的忠實(shí)度提高100倍。然而，DNA聚合酶的校正作用并非絕對平安，有些錯誤插入的核苷酸會逃脫檢測，并在新合成的鏈與模板鏈之間形成錯誤配對。在下一輪復(fù)制時(shí)錯誤插入的核苷酸將指導(dǎo)與其互補(bǔ)的核苷酸插入到新合成的鏈中，結(jié)果導(dǎo)致DNA序列中產(chǎn)生一個(gè)永久性改變。DNA的錯配修復(fù)系統(tǒng)〔mismatchrepair〕可以檢測到DNA復(fù)制時(shí)錯誤插入并漏過校正檢驗(yàn)的任何堿基，并對之進(jìn)行修復(fù)，將DNA合成的精確性又提高了2～3個(gè)數(shù)量級，對維護(hù)DNA復(fù)制的正確性十分重要。由于復(fù)制中出現(xiàn)的錯配堿基存在于子鏈中，因此該系統(tǒng)必須在復(fù)制叉通過之后有一種能夠識別親本鏈與子鏈的方法，以保證只從子鏈中糾正錯配的堿基。我們已經(jīng)知道大腸桿菌染色體DNA是被甲基化的。DNA腺嘌呤甲基化酶〔DNAadeninemethylase,Dam〕將GATC序列中的A修飾成6-甲基腺嘌呤。DNA胞嘧啶甲基化酶〔DNAcytosinemethylase,Dcm〕將CCAGG和CCTGG中的C修飾成5－甲基胞嘧啶。這三種序列都是回文序列，所以DNA分子兩條鏈的甲基化程度是相同的。這些甲基化的堿基并不干擾堿基間的正常配的，6-甲基腺嘌呤和5-甲基胞嘧啶仍與T和G形成正確的堿基配對。類似的情況是胸腺嘧啶〔即5-甲基尿嘧啶〕和尿嘧啶都與A配對。剛完成復(fù)制的DNA，舊鏈?zhǔn)羌谆?，但新鏈要在?fù)制完成幾分鐘后才被甲基化。剛完成復(fù)制的DNA保持幾分鐘的半甲基化狀態(tài)為錯配修復(fù)系統(tǒng)提供了一個(gè)識別親本鏈和子鏈的根底。大腸桿菌主要的錯配修復(fù)系統(tǒng)，MutSHL通過判斷GATC序列是否發(fā)生甲基化來識別新生鏈和模板鏈。大腸桿菌中許多與DNA修復(fù)有關(guān)的基因用mut〔mutator〕表示，原因是這些基因發(fā)生突變會導(dǎo)致有機(jī)體的突變率增高。六、重組修復(fù)〔recombinationalrepair〕

在討論重組修復(fù)機(jī)制之前，有必要先分析一下胸腺嘧啶二聚體對DNA復(fù)制的影響。當(dāng)聚合酶III遇到胸腺嘧啶二聚體時(shí)，會在二聚體位點(diǎn)停頓下來。這時(shí)，細(xì)胞會在二聚體的下游開始下一個(gè)岡崎片段的合成，新生鏈在二聚體對應(yīng)的位置上出現(xiàn)一個(gè)缺口。通過重組過程可填補(bǔ)新生鏈上的缺口。缺口可用圖所示的DNA重組方式填補(bǔ)：①受損DNA復(fù)制時(shí)，一條子代DNA分子在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。②另一條子代DNA分子完整的母鏈與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，母鏈DNA上相應(yīng)的片段被用于填補(bǔ)子鏈上的缺口，而母鏈DNA出現(xiàn)又出現(xiàn)一個(gè)新的缺口。③母鏈上的缺口再以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段進(jìn)行填補(bǔ)，最后由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。

一個(gè)雙鏈損傷變成兩個(gè)單鏈損傷重組修復(fù)并不能去除損傷，損傷仍然保存在原來的位置。但是重組修復(fù)能使細(xì)胞完成DNA復(fù)制，并且新合成的子鏈?zhǔn)峭暾?。?jīng)屢次復(fù)制后，損傷就被“沖淡〞了，在子代細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞是帶有損傷DNA的。重組修復(fù)機(jī)制對于細(xì)胞處理不易被修復(fù)或者不能被修復(fù)的損傷有著特殊的意義。RecombinationalRepair5’5’3’3’3’5’Thymine

dimerThymine

dimerUndamagedparentalstrand‘recombines’intothegapoppositethedimer,leavingagapontheotherparentalstrand.5’5’3’3’3’5’Recombinationisdependent

RecAproteinRecombinationalRepairThegapintheundamagedparentalstrandisfilledbyDNApolIandligase.Thethyminedimercannowberepairedbyexcisionrepair5’5’3’3’3’5’Thymine

dimerThymine

dimer5’5’3’3’3’5’RecombinationalRepair(Post-ReplicationRepair)DNAreplicationStructuraldistortionExcisepatchfromintactstrandandinsertingapRepairgapExcisionrepair?(RecA)六、SOS反響〔SOSresponses〕1.SOS反響：當(dāng)DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，染色體的DNA復(fù)制被抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生SOS反響：大約20個(gè)與DNA損傷修復(fù)和DNA復(fù)制功能恢復(fù)有關(guān)的基因的表達(dá)水平升高，細(xì)胞的DNA修復(fù)能力得到加強(qiáng)，甚至出現(xiàn)DNA的跨損傷〔translesionsynthesis〕合成。2.SOS反響的誘導(dǎo)當(dāng)DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷后，由于細(xì)胞內(nèi)的切除修復(fù)和重組修復(fù)致使DNA單鏈局部在細(xì)胞中積累。RecA蛋白因與單鏈DNA結(jié)合而被活化，活化后的RecA蛋白再與LexA結(jié)合，引起LexA的自切，解除LexA對SOS基因的阻遏作用。3.SOS基因：在SOS反響中，SOS基因是按照一定的順序被誘導(dǎo)表達(dá)的。SOS基因的表達(dá)時(shí)間由LexA與基因的SOS框的親和力決定。按照在SOS反響中的表達(dá)時(shí)期，可以大致把SOS基因分為3組。首先被誘導(dǎo)的SOS基因是一些參與單鏈損傷修復(fù)的基因〔比方，uvrA，uvrB，uvrD〕或者與損傷耐受性有關(guān)的基因〔比方，polB〕。編碼LexA和DinI的基因也在這一時(shí)期被誘導(dǎo)表達(dá)。DinI的功能是延遲激活跨損傷的DNA合成。如果參與單鏈修復(fù)的基因不能幫助恢復(fù)正常的DNA合成速度，參與重組修復(fù)的基因便被誘導(dǎo)表達(dá)，它們包括recA和