胚胎移植課件

動物克隆研究現(xiàn)狀及其展望一、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

（一）概述

動物胚胎工程是當今生物工程的研究熱點之一，目前主要向兩頭延伸：胚胎工程推廣應(yīng)用高深研究（胚移產(chǎn)業(yè)化）（克隆、轉(zhuǎn)基因）

分子克?。喝斯U增生物大分子

克?。–lone）細胞克?。杭毎?/p>

（無性繁殖）

胚胎細胞克隆

個體克?。押艘浦玻?/p>

體細胞克隆克隆源於希臘文，原意為樹木的枝條，在生物學中系指一個細胞或個體以無性繁殖的方式產(chǎn)生一群細胞或一群個體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱為無性繁殖系。細胞核移植技術(shù)：將供體細胞核移入除去核的卵母細胞中，使後者不經(jīng)過精子穿透等有性過程即無性繁殖就可被啟動、分裂併發(fā)育成新的個體、使得核供體的基因得到完全複製。（二）哺乳動物胚細胞核移植胚胎細胞克隆重大進展技術(shù)基本成熟：如1枚牛胚獲得了7頭活牛犢。繼代克?。号＿B續(xù)克隆至第7代，獲得了第3代犢牛，1枚胚連續(xù)克隆獲得了190枚胚胎；山羊繼代克隆5代共獲得了45只不同代的後代，1枚胚連續(xù)克隆獲得了298枚胚胎。（類）胚胎幹細胞系的建立：僅在小鼠上建立了ES系（Evans&Kaufman,1981;Martin,1981），意義很大，可用ES細胞進行核移植。1995年，英國學者Campbell等，利用9.5天綿羊胚胎滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)傳3代後作為核供體獲得了後代，曾被評為96年世界十大科技新聞之一。1999年，小鼠ES細胞克隆獲得成功（Wakayamaetal.,1999），用長期培養(yǎng)的牛PGCs克隆後獲得了一頭公牛（Muelleretal.,1999）。（三）體細胞克隆進展成年體細胞：綿羊Dolly，乳腺上皮細胞，Wilmutetal.(1997)；小鼠30餘只，卵丘細胞，Wakayamaetal.(1998)；牛，卵丘細胞（5），輸卵管上皮（3），Katoetal.(1998)；老牛顆粒細胞（2），傳代凍解，Wellsetal.(1998)；乳腺上皮原代細胞（1）與耳皮膚成纖維細胞（1），Zakhart-chenkoetal.(1999)；肌肉細胞（4），傳4代，Shigaetal.(1999)；耳皮膚成纖維細胞培養(yǎng)3個月傳15代，Kubotaetal.(2000)；山羊，張湧等（2000）；成勇等（2000）；Keeferetal.(2000)。豬，顆粒細胞核移植胚二次核移植，Polejaeveaetal.(2000)。胎兒成纖維細胞：綿羊，3只，Wilmutetal.(1997）；6只，Schniekeetal.(1997）；牛，Cibellietal.(1997);；Butler(1998)；Zakhartchenkoetal.(1999)；Vignonetal.(1999)；山羊，Baguisietal.(1999)；豬，Onishietal.(2000)。（四）哺乳類異種動物克隆研究進展指核供體細胞與核受體細胞來源於兩個不同的種系。研究報導(dǎo)不多。尚未見有異種克隆個體產(chǎn)生的報導(dǎo)，但有一些獲得異種克隆囊胚甚至胎兒的報導(dǎo)。大熊貓成年體細胞與去核兔卵母細胞重建得到了異種體細胞克隆囊胚（陳大元等，1999）。二、動物克隆的技術(shù)路線（一）供體核的分離技術(shù)1.胚細胞用0.2%鏈黴蛋白酶預(yù)處理胚胎,然後機械法剝離透明帶,鈍頭玻璃吸管反復(fù)吹吸以分離成單個卵裂球。2.體細胞最早是用青蛙腸粘膜上皮細胞的核獲得後代。Wilmut等將綿羊乳腺細胞在特定的實驗條件下增殖培養(yǎng)6天，誘使細胞處於靜止狀態(tài)，以便染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)整和核進行重組，從而獲得了克隆綿羊“多莉”，開創(chuàng)了哺乳動物體細胞核移植（克?。┑男录o元。（二）受體細胞的去核技術(shù)現(xiàn)一般均採用超數(shù)排卵回收的卵母細胞或體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞，並將其置於含細胞鬆弛素B和秋水仙胺的培養(yǎng)液中，一端用固定吸管固定，另一端用一尖頭吸管（Ф30μm）穿透透明帶進入卵周隙，或用一細長玻璃針刺破並切開一部分透明帶，再用呈直角的去核吸管經(jīng)切囗抵住細胞膜，操縱去核吸管，從第1極體外吸除第一極體及時性於分裂中期的染色體和周圍的部分細胞質(zhì)。（三）核卵重組技術(shù)在顯微操作儀操縱下，用去核吸管吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去除核的受體卵母細胞的卵周隙中。（四）重組胚的融合技術(shù)由於微吸管破壞了卵膜及一部分細胞質(zhì)，若直接移植則成功很低，故需對重組胚進行融合，現(xiàn)多採用電融合法,將重組胚置於融合小室內(nèi)，使核一質(zhì)集結(jié)面與電極相平行，在一定的電場強度下，給予一定時間的矩型直流電脈衝促使其融合。（五）核移植胚的培養(yǎng)與移植或重複克隆技術(shù)融合後的胚胎在體外培養(yǎng)或經(jīng)過中間受體培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚，然後移入與胚齡同期的受體動物子宮角內(nèi)，可望獲得克隆後代。獲得的早期胚也可作為供體核重新克隆。三、意義及發(fā)展前景（一）意義為動物胚胎發(fā)生、死亡及其調(diào)控以及人的生長、衰老等研究提供研究手段。為許多研究如肝癌等提供大量遺傳性狀一致的動物模型。提供人體代用器官或生產(chǎn)大量生物藥品。優(yōu)秀種畜的快速純繁擴群，加快新品種選育的進程。拯救珍貴瀕危動物。（二）發(fā)展前景進展快、意義大，但還有許多問題有待解決，仍是當今生物界研究的熱點。2000年武漢動物繁殖研討會上，眾多專家認為，十五期間，在胚胎移植產(chǎn)業(yè)化的同時，克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎幹細胞等研究將會有更大的進展，建議並相信國家會有更大強度的資助。

四、我們實驗室擬開展的

研究工作

南京農(nóng)業(yè)大學

動物胚胎工程技術(shù)中心去年底借搬遷實驗室之際，我們對原有的胚胎室進行了擴充，面積達到了100M2，並為克隆預(yù)留了無菌室。利用學校貸款新添置了CO2培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、電子天秤等儀器。最近校長投資50萬元用於購置顯微操作系統(tǒng)等。最近學校正式成立校級動物胚胎工程技術(shù)中心，並在為下一步申請成立省級動物胚胎工程技術(shù)作準備。目前本中心直接從事胚胎工程研究的人員有4名教師與近10名研究生。（一）胚胎幹細胞系的建立胚胎幹細胞具有全能性與無性繁殖兩大特點，為克隆動物無限量地提供種質(zhì)資源。早在80年代初世界上就已建立了小鼠ES細胞系，但其他一些動物只是建立了類ES細胞系。這次全國動物繁殖研討會上，專家一致認為，攻克並建立ES細胞系已迫在眉睫。我們實驗室已有多年從事胚胎與細胞培養(yǎng)的經(jīng)驗，以此為出發(fā)點，近期先建立類ES細胞系是完全可能的。（二）體細胞克隆的研究

克隆的目的在於大量繁殖經(jīng)濟價值高的良種或稀有動物。我們選擇以名犬或種羊為對象，其數(shù)量少、價值高，不僅科學上有突破意義，而且為將來開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。南京警犬研究所是公安部直屬的、集警犬科研與養(yǎng)殖的大型研究所，可以為該項研究提供寶貴的種質(zhì)資源。種羊可選用波爾山羊或綿羊無角道賽特等。目前先開始用兔作試驗。

注核

移植

一群名犬或種羊

名犬或種羊克隆示意圖卵母細胞

去核

去核卵母細胞

皮膚組織皮膚細胞體外傳代

五、關(guān)於克隆人的問題

一、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

早在100多年前就進行過體外受精嘗試；

1951年，精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，是體外受精的里程碑；

50—70年代，實驗動物上進行了大量研究，並取得了成功；

80年代以來，由於對胚胎需求量的加大，促進了家畜體外受精的研究，牛、綿羊、山羊、豬等相繼獲得了成功，國內(nèi)在90年代也在家畜上取得了成功。

現(xiàn)已將卵母細胞體外成熟—體外受精—早期胚體外發(fā)育，甚至冷凍保存結(jié)合在一起，建立工廠化生產(chǎn)胚胎的成套技術(shù)，以大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價廉的胚胎。

二、卵巢卵母細胞的獲得與體外成熟培養(yǎng)

（一）卵巢卵母細胞的獲得1.活體卵巢上採集

母畜超排處理后，利用剖腹術(shù)或腹腔鏡技術(shù)已能成功地采集卵泡卵母細胞。2.屠宰後卵巢上採集

(1)卵巢的採集與保存:宰後立即無菌採集,30--37度滅菌生理鹽水中6H內(nèi)運回實驗室。

(2)卵巢表面卵泡細胞的獲得

1)抽取法:18號針頭;最常用;

2)剝離法:

3)切開法:3.卵巢內(nèi)卵泡卵母細胞的獲得

數(shù)量多，用一組特制刀片對卵巢組織進行深部切割，采卵率約提高1倍。

（二）卵母細胞的篩選

只有周圍包被著完整卵丘（A級）或部分卵丘脫落（B級）、胞漿均質(zhì)並充滿於透明帶內(nèi)的卵母細胞才能進行成熟與胚胎發(fā)育的培養(yǎng)。

（三）卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)1.成熟培養(yǎng)液與培養(yǎng)條件

最常用的是碳酸氫鈉或Hepe’s緩衝的TCM-199;

5%CO2、飽和濕度、38.5--39度，24H。2.成熟培養(yǎng)中添加成分的影響

1)促性腺激素與E2的影響

2)EGF的影響

3)顆粒細胞的影響:低濃度能促進成熟分裂

4)血清的影響

三、牛精子的體外獲能與體外受精

（一）精子的洗滌與體外獲能1.BO液類

鮮精或凍精解凍后離心洗滌約2次,每次5-10分鐘,最後的精子小滴懸浮成1-10X106/ML。

常用咖啡因-肝素-BSA使精子獲能。2.改良Tyrode液（TALP）類

1）上浮法

2）Percoll法

（二）體外授精授精通常在覆蓋下的微滴中進行，微滴以50--100微升為宜，一般每滴中加5--10個卵母細胞，精子最終濃度為0.64--1X106個/ML5%CO2、39度培養(yǎng)，BO液中6-8H，TALP液中18-24H。

四、其他哺乳動物精子的體外獲能與體外受精特點（一）豬鮮精或凍精用0.9%氯化鈉-1mg/mlBSA洗3次，然後用改良臺氏液或TCM-199液稀釋至108個/ml、5%CO2、39度獲能孵育60min，最後在受精液（2-10mM咖啡因、10mg/mlBSA）中授精，精子最終濃度為105

個/ml，條件為5%CO2、39度培養(yǎng)4-5h。（二）山羊Hanada等用鈣離子載體法獲能，受精率達50%，獲得了世界首例試管山羊。劉靈等用肝素和BSA獲能，受精率最高達89.7%，並獲得了世界首例卵泡卵母細胞體外受精後代。

（三）綿羊

方法與牛相似。

五、早期胚的體外發(fā)育

不同的動物早期胚胎體外發(fā)育都存在阻斷期，體外發(fā)育培養(yǎng)時需要一些特殊的培養(yǎng)條件如共同培養(yǎng)細胞，以克服阻斷，但目前的發(fā)育率仍然比較低，約為40%，是限制體外受精應(yīng)用的一個突出問題。

六、胚胎冷凍保存（一）常規(guī)的慢速冷凍法

冷凍液1.5M甘油+0.25M蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP和1.5M乙二醇+0.25蔗糖+PBSS液+0.1mg/mlPVP

冷凍步驟為：①在室溫下，先將牛胚胎放入防凍液中平衡一段時間；②裝管；③以每分鐘0.3~0.5℃的速度降溫至–35℃；④植冰；⑤平衡10分鐘後，投入液氮中保存。（二）玻璃化冷凍

冷凍液：EFS40：40%乙二醇+0.3M蔗糖+18%聚蔗糖+PBSS

冷凍步驟：首先將胚胎放入20%乙二醇溶液（EFS20）中平衡5min後，用移卵管移入玻璃化溶液中平衡10min，然後裝管，封口。把細管直接投入液氮冷凍保存。

七、影響體外受精的因素（一）卵母細胞的成熟度（二）精子體外獲能胚胎移植及其意義國內(nèi)外牛羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化進展胚胎移植的基本原則胚胎移植技術(shù)路線一、胚胎移植及其意義胚胎移植是指將一頭良種母畜配種後的早期胚胎取出，移植到另一頭同種且生理狀態(tài)相同的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體的過程。實際上是由產(chǎn)生良種胚胎的供體和養(yǎng)育胚胎的受體分工合作共同繁殖後代的技術(shù)。意義：提高良種母畜的繁殖利用率，加快良種純繁速度；加快品種的選育進程；代替種畜直接進口；拯救瀕危動物；研究手段。

二、國內(nèi)外牛羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化進展

胚胎移植技術(shù)是20世紀畜牧業(yè)中繼人工授精技術(shù)之後又一次巨大變革，業(yè)已成為一項充分發(fā)揮優(yōu)良母畜繁殖潛力的實用繁殖新技術(shù)。國際間胚胎貿(mào)易非?；钴S，早在1994年，全世界僅胚胎移植牛就已超過350，000頭，其中進出口的胚胎約占總數(shù)的10%，羊胚胎年產(chǎn)總量雖較低，約為牛胚胎的5-10%，但進出口比例更高。近年來，國際上胚胎的產(chǎn)量和貿(mào)易量則成倍增長。美國、加拿大、法國、新西蘭、澳大利亞等發(fā)達國家成立了上百家胚胎移植公司；美國、法國等近年參加後裔測定的青年公牛中80%以上為胚胎移植的後代。牛羊凍胚移植的成功率達到了50-60%。我國的胚胎移植技術(shù)也已相當成熟，九五期間，全國在肉牛、奶牛上分別移植受體4955、3926頭，平均妊娠率達到51.5%。去年全國通過胚胎移植獲得的波爾山羊數(shù)可望達到800只以上。

三、胚胎移植的基本原則（一）胚胎移植前後所處的環(huán)境應(yīng)是相同或相似的

1．供體和受體在種屬上必須一致

2．供體和受體在生理上必須一致供、受體在發(fā)情時間上應(yīng)同期化，一般相差不超過24h，否則移植成功率顯著下降。

3．從供體中收集胚胎的部位與給受體移植胚胎的部位必須一致即從供體子宮角內(nèi)收集到的胚胎應(yīng)該移植到受體的子宮角內(nèi)。（二）移植的時間要適宜胚胎收集與移植的時間不能超過週期黃體的壽命，因此，胚胎的收集時間不能超過發(fā)情配種後第7天，最好是在發(fā)情配種後的第5-7天內(nèi)進行。

（三）胚胎的發(fā)育應(yīng)當正常胚胎的收集及移植過程應(yīng)當嚴格按照要求進行，儘量不使其受到物理、化學或生物方面的影響。同時，胚胎移植前需進行鑒定，確定其發(fā)育正常者才能進行移植。

四、胚胎移植技術(shù)路線（一）供、受體的選擇供體的選擇

1．供體應(yīng)是良種，而且為性狀表現(xiàn)優(yōu)秀、具有較高育種價值的個體。

2．供體應(yīng)健康無病，膘情中等偏上，年齡以青壯年為佳，如羊上，可選初產(chǎn)羊及8歲以內(nèi)的經(jīng)產(chǎn)羊作為供體。

3．供體生殖機能應(yīng)處在較高水準。既無難產(chǎn)、流產(chǎn)等繁殖病史，也無子宮卵巢疾病，超排處理前應(yīng)有兩個或兩個以上的正常情期。

受體的選擇

1．受體一般選用價格低廉、生產(chǎn)性能比較低的同種母畜。

2．受體要具有良好的健康狀態(tài)，體型中上等，初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)青壯年母畜。檢疫和疫苗接種與供體相同。

3．受體應(yīng)具有良好的繁殖性能，既無難產(chǎn)、流產(chǎn)等繁殖病史，也無子宮卵巢疾病，移植胚胎前應(yīng)有兩個或兩個以上的正常情期。（二）受體的同期發(fā)情

1.前列腺素處理法PGF2α或其類似物有溶解黃體的作用，黃體溶解後，卵巢上就會有卵泡發(fā)育而發(fā)情，所以只能對於卵巢上存在黃體的受體有效。在發(fā)情週期的第九天以後，注射PGF2α

，?？稍谧⑸溽?-3天內(nèi)發(fā)情。在繁殖季節(jié)，如不能確定受體的發(fā)情週期，可採用兩次注射法，受體第1次注射後，凡卵巢上有功能黃體的個體即可在注射後發(fā)情，選出發(fā)情個體做為受體。其他間隔10-12天第2次注射。此方法方便可靠，但費用較高。2.孕激素處理法孕酮能夠抑制腺垂體釋放FSH，每日肌注或口服孕酮，或經(jīng)陰道海綿栓給予孕酮或其類似物，一般處理12-18天後，可以抑制卵泡發(fā)育。停止處理或撤除海綿栓後，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡發(fā)育，從而使受體發(fā)情。通常在停止處理或撤除海綿給後2-3天內(nèi)發(fā)情。為了提高排卵的效率，在孕激素處理結(jié)束的前一天，給予小劑量的FSH是非常必要的。此法費用低，但處理時間長。(三)供體的超數(shù)排卵與人工授精在母畜（供體）發(fā)情週期的某一時期，用外源性的促性腺激素處理，從而促使其卵巢上較正常有更多個卵泡同時發(fā)育，並且能夠同時或準同時排出多個具有受精能力的卵子，這一技術(shù)稱為超數(shù)排卵，筒稱“超排”。供體羊的超排方案：在發(fā)情週期第10、11、12天每只羊分別肌注FSH100、80、60單位，末次肌注時同時注射PG2ML/只，24H後再肌注HCG500單位。發(fā)情後供體配種2—3次。供體牛的超排方案：在發(fā)情週期第10、11、12、13天每頭牛分別肌注FSH160、140、110、90單位，每天分兩次注射，在第12天注射FSH的同時肌注PG，上午2支/頭，下午1支/頭。發(fā)情後供體配種2—3次。 (四)胚胎的收集1.沖卵液和保存液的製作沖卵液有很多種，目前最常用的為含5%犢牛血清的杜氏磷酸鹽緩衝液（D-PBSS），也可用於體外短期保存胚胎。保存時間長或體外培養(yǎng)多用M-199液。D-PBS和M-199液或其他培養(yǎng)液一般都有成品出售。2.羊胚胎的回收(1)術(shù)前準備場所、器械和人員的準備供體羊的術(shù)前準備：術(shù)前一日停止餵食但不停水、術(shù)部剃毛；手術(shù)前的麻醉採用硬膜外麻醉結(jié)合局部浸潤；術(shù)部皮膚先用2-4%的碘酒消毒，晾乾後再用70%—75%的酒精棉塗擦脫碘。將創(chuàng)巾固定在術(shù)部周圍並露出術(shù)部。

(2)手術(shù)過程皮膚用外科刀一次切開，4—6釐米。肌肉用鈍性分離的方法沿肌纖維的走向分層切開，最後切開腹膜。切開過程中注意及時止血。手術(shù)者將食指及中指由切口伸入腹腔觸摸子宮角，用二指夾持，因勢利導(dǎo)地牽引至創(chuàng)口表面，先循一側(cè)的子宮角至該側(cè)的輸卵管，在輸卵管的末端彎轉(zhuǎn)處找到該側(cè)的卵巢，觀察卵巢表面的排卵點和卵泡發(fā)育情況並做記錄。（3） 沖洗輸卵管法適宜於2--3日齡的胚胎；將一根長5~7cm，外徑3~4mm的矽膠管插入輸卵管喇叭口內(nèi)1~1.5cm，用血管夾固定。左手掌心向上，以母指和食指捏住子宮角前端，右手持吸有沖卵液的針管並將針頭插入子宮角尖端，注入沖卵液約80—100ML。（4）沖洗子宮法適宜於5--7日齡胚胎；在一側(cè)子宮角中部大彎處用止血鉗尖端刺透子宮壁，插入沖胚導(dǎo)管（二通式醫(yī)用導(dǎo)液管），嚮導(dǎo)管氣囊打氣3—5ml。在導(dǎo)管頂端前方，向?qū)m管接合部插入套管針，抽出針芯，由此向?qū)m管部緩慢注入沖胚液30—60ml，沖胚液邊注入邊由導(dǎo)管排出，用三角瓶接收回流沖胚液。最後用手指輕輕壓擠子宮角，讓沖胚液完全排出。用同法沖另一側(cè)子宮角。沖胚後將子宮角送回原處，腹腔內(nèi)注入油劑氯黴素5ml，閉合腹壁。術(shù)後肌肉注射氯前列烯醇0.2ml，全身用抗菌素1日。3.牛胚胎的回收適宜於5--7日齡胚胎;

現(xiàn)均採用二通管非手術(shù)采卵法：用直腸把握子宮頸法插入帶有探針的二通管直至一側(cè)子宮角的基部，通過打氣空注入8--10ML空氣,抽出探針，通過中心管道反復(fù)注入--回收沖卵液,連續(xù)5--6次。同樣方法沖另一側(cè)子宮角。（五）胚胎的檢查和評定回收到的沖洗液盛於玻璃器皿中，37℃靜置10分鐘，待胚胎沉降到器皿底部，移去上層液後開始檢卵，檢查胚胎發(fā)育情況和數(shù)量多少。在連續(xù)變倍解剖顯微鏡（實體顯微鏡）下進行檢卵。胚胎的品質(zhì)評定：主要採用形態(tài)學方法，優(yōu)質(zhì)胚胎才能用於進行胚胎冷凍或移植。（六）胚胎的移植羊採用手術(shù)法將胚胎移入輸卵管或子宮角前端。牛採用非手術(shù)法，用移植槍將胚胎移入輸卵管的前端。

胚胎幹細胞（Embryonicstemcells，ES細胞）是一種從早期胚胎內(nèi)細胞團（Innercellmass，ICM）或原始生殖細胞（primordialgermcells，PGCs）經(jīng)體外分化、抑制培養(yǎng)、分離和克隆得到的具有發(fā)育全能性的細胞。目前，ES細胞已經(jīng)引起廣大學者的注意和興趣，對ES細胞的研究也取得了很大進展。

1.ES細胞的研究概況

ES細胞研究，首先源於畸胎瘤細胞（Teratocarcinomastemcell）或胚胎瘤細胞（Embryoniccarcinomacell，ES細胞）。1958年，Steven通過把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精巢或腎臟被膜下得到了EC細胞[1]。隨後，EC細胞常被用以研究哺乳類動物發(fā)育和遺傳以及細胞誘導(dǎo)分化的實驗?zāi)Ｐ?，通過各種誘導(dǎo)因數(shù)和實驗條件，成功地誘導(dǎo)出神經(jīng)細胞、肌肉細胞、軟骨細胞和上皮細胞等包括三個胚層在內(nèi)的各種類型的分化細胞。1974年，Brinster把EC細胞注射到胚泡腔後，EC細胞參與受體胚胎的發(fā)育，從而得到了嵌合體。1981年，Mintz等培養(yǎng)的METT-1系EC細胞具有與生殖腺嵌合的能力[2]。但是由於EC細胞種系間的嵌合率低，僅有13%，而且EC細胞具有腫瘤源性，生成的嵌合體到了成年又出現(xiàn)腫瘤，建成的EC細胞系有異常核型。因此EC細胞作為研究正常細胞分化的模型並不理想。

1981年，Evans和Kaufman首先在EC細胞研究的基礎(chǔ)上，通過對延遲著床的小鼠早期胚胎進行體外培養(yǎng)，首次分離得到小鼠ES細胞，並以兩個人名字的開頭字母命名為EK細胞，並建立了ES細胞系[3]。隨後，人們相繼建立了其他動物的類ES細胞。Doetschman(1988)、Piedrahita(1990)建立了倉鼠的ES細胞系。Notarianni(1990)、Piedrakita(1990)、Strojek(1990)、Anderson(1990)和Wheeler(1994)各自成功的建立了豬的類ES細胞系；Sukoyan(1992)建立了水貂的類ES細胞系。Saito(1992)、Strelchenko(1994)和Stice(1993)建立了牛的類ES細胞系，Sims(1993)對ES細胞進行核移植，得到四頭犢牛，Cibelli用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了生殖系嵌合體牛。Craves(1993)、Niemann(1994)建立了兔的類ES細胞系。Tsuchiya(1994)、Meinecke、Tillmann(1996)建立了綿羊ES細胞系，Campbel於1996年對綿羊ES細胞系進行核移植，得到了四只羔羊。Bongso(1994)、Meineke-Tillmann(1996)建立了山羊的類細胞系。1994年，Bonso建立了人的類ES細胞系，1998年，Tillhomoson等建立了人的類ES細胞系，並進行了鑒定，其中，H9株傳32代，並能成功地進行冷凍和解凍。該細胞的核型正常，AKP、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-18染色均為陽性，體內(nèi)體外分化試驗證明具有多能性[4]。

我國尚克剛（1989，1993，1994），叢笑倩（1990）也分別建立了小鼠的ES細胞系，並得到了嵌合體小鼠。1991年，陳立人建立了小鼠和豬的類ES細胞系。1995年，賴學良建立了兔的ES細胞系，並得到了一只皮毛嵌合體小鼠。1999年，張學明對利用小鼠胚胎成纖維細胞製作飼養(yǎng)層進行了研究，發(fā)現(xiàn)了2日齡到13日齡之間的小鼠胚胎最適於分離小鼠原代胚胎成纖維細胞[5]

西北農(nóng)業(yè)大學，從1994年開始，用早期胚胎相繼分離克隆出的類ES細胞，最多傳五代（1995，1997，1999）；牛的類ES細胞，最多傳六代（1995，1998，1999）；小鼠的類ES細胞，最多傳九代；1997年用分離流產(chǎn)胎兒原始生殖細胞克隆出人的類ES細胞，最多傳六代；1999年分離克隆出牛的類ES細胞，傳15代，並進行了冷凍保存[6]。特別是近幾年來，由於對人的類ES細胞的研究取得了很大進展，國內(nèi)外掀起了一股ES細胞的研究熱潮。

2.ES細胞的形態(tài)學特徵及基本特徵2.1ES細胞的形態(tài)學特徵

ES細胞核大，胞質(zhì)胞漿少，細胞界限不明顯。體外培養(yǎng)時，細胞排列緊密，呈集落狀生長，邊緣折光性強，集落邊緣可見有少量的已經(jīng)分化為扁平上皮細胞或梭形的成纖維細胞。用鹼性磷酸酶染色法染色，ES細胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細胞則呈淡黃色[7]。小鼠胚胎幹細胞的直徑在7-18um之間，豬、牛和羊的ES細胞顏色較深，直徑為12-18um[8]?？偟膩碚f，ES細胞具有與胚胎細胞相似的形態(tài)特徵。2.2ES細胞的基本特徵

2.2.1全能性

ES細胞的全能性（totipotenty），是指ES細胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細胞發(fā)育成完整動物體的能力。其實質(zhì)是細胞基因組中決定蛋白質(zhì)編碼的所有基因按一定的時空順序依此表達。ES細胞是能在體外大量增殖的全能性細胞，可以為細胞的遺傳操作和細胞分化研究提供豐富的實驗材料。ES細胞全能性的檢測方法是以胚胎幹細胞進行細胞核移植。如果ES細胞能和去核的細胞融合發(fā)育成重構(gòu)胚，而且經(jīng)過胚胎移植，重構(gòu)胚能發(fā)育形成個體，則表明ES細胞具有全能性。例如，Campkell將綿羊的類ES細胞注射到去核卵母細胞中，獲得重構(gòu)。重構(gòu)胚經(jīng)過胚胎移植，有活的羔羊產(chǎn)生，證明了綿羊的類ES細胞具有發(fā)育全能性[9]。2.2.2多能性

多能性（Pluripotency）是指ES細胞具有發(fā)育成多種組織的能力，參與部分組織的形成。細胞多能性檢測的方法很多，主要有：1.體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化試驗將ES細胞培養(yǎng)在不含分化抑制物的培養(yǎng)基上，可以形成類胚體（Embryoidbodies）。2.將ES細胞在特定培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，定向分化成特定組織。例如，在含有白血病抑制因數(shù)（LIF）和維生素A酸（RA）的培養(yǎng)基可以分化形成體壁內(nèi)胚層。3.將ES細胞懸液（1-2×107個/ml）注射入同原動物皮下，形成組織瘤，可以形成內(nèi)胚層，中胚層，外胚層。4.胚胎嵌合法，將ES細胞與胚胎細胞共同培養(yǎng)或者將ES細胞注射入囊胚腔中，ES細胞就會參與多種組織發(fā)育。如Kaufman首次用小鼠ES與囊胚嵌合，獲得了第一個生殖腺嵌合體小鼠，表明ES細胞具有發(fā)育多能性。

利用骨髓基質(zhì)細胞或其條件培養(yǎng)液，可誘導(dǎo)ES細胞在體外分化為造血幹細胞（transforminggrowthfactorB，TGF-B）的ES細胞，在維甲酸（RA）培養(yǎng)液經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成抑胚體，再繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，可見擬胚體周圍有許多由內(nèi)皮細胞排列而成的輻射狀血管樣結(jié)構(gòu)；ES細胞在RA與雙丁醯基環(huán)腺苷磷酸（dibutyrylcyclicadenosinemonohosphatedBcAmp）共同作用下，可以分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞；在RA誘導(dǎo)下，ES細胞可分化為肌細胞；ES或EG細胞經(jīng)懸滴培養(yǎng)形成的擬胚體在二甲基亞碸（DMSO）、胰島素，三碘腺原氨酸（triiodofhgronine）、胎牛血清或維甲酸（RA）的共同作用下可分化為脂肪細胞；ROSAB-geo基因傳染的ES細胞在缺乏G418、含有10%小牛血清，1umol/L低塞米松（dexamethason）條件下可以分化成軟骨細胞[10]。

此外，也可以通過測定時期專一性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigenSSEA）.鹼性磷酸酶（AKP）、OCT-4基因、端粒酶（telomerase）等發(fā)育全能性標誌來確定。ES細胞表達SSEA，因此常用單克隆抗體SSEA-1檢測ES和EG細胞表面抗原作為發(fā)育全能性的標誌。ES和EG等未分化幹細胞具有較AKP高的活性。而在已分化的細胞中，活性則明顯降低。OCT-4是一種發(fā)育全能性的標誌基因，在小鼠胚胎發(fā)育早期，生殖細胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能幹細胞都能特異性的表達OCT-4基因，而分化細胞則無OCT-4基因表達。端粒酶是一類核糖糖蛋白，與維持真核細胞染色體末端的端粒長度以及控制細胞壽命有關(guān)。人ES細胞端?；钚院芨?，而分化細胞則一般難以檢測到其活性[11]。

3.ES細胞系的建立概況及建系的技術(shù)要點：3.1ES細胞系的建立概況

迄今為止，小鼠與人的ES細胞系已經(jīng)成功建立，其他動物如倉鼠、豬、牛、水貂、兔、山羊的類ES細胞系也相繼建立，在牛、兔上還得到了轉(zhuǎn)基因嵌合體動物[12]。

3.2ES細胞建系的技術(shù)要點

ES細胞建系的原理是將早期胚胎（桑椹胚或囊胚）或者是用外科手術(shù)法得到的內(nèi)細胞團（Innercellmass，ICM）或者原始生殖細胞（primordialgermcells，PGCs）與分化抑制物共同培養(yǎng)，使之增值而又保持未分化狀態(tài)，這樣代代相傳，從而使數(shù)量有限的胚胎或者PGCs細胞能夠成千上萬倍地克隆。其建系的基本技術(shù)要點如下：

3.2.1飼養(yǎng)層的製備及分化抑制物的選擇

常用的飼養(yǎng)層是由小鼠成纖維細胞無限系（STO）或小鼠原始胚胎成纖維細胞（PMEF）製備而成，STO或PMEF經(jīng)過絲裂黴素C等有絲分裂抑制劑處理後，與早期胚胎或PGCs共同培養(yǎng)後，ES細胞就可以分離出來了。STO和PMEF細胞可以分泌成纖維細胞生長因數(shù)FGF（fibroblastgrowthfactor）、分化抑制因數(shù)LIF(leukemiainhibitoryfactor)，這些因數(shù)有助於ES細胞增值，而且能抑制細胞的凋亡和分化。此外，也可以用綿羊、山羊的輸卵管或子宮上皮、牛的顆粒細胞、子宮成纖維細胞等作為分化抑制培養(yǎng)基[13]。3.2.2早期胚胎及PGCs的選擇和分離

以下早期胚胎都可以作為建立胚胎幹細胞系的材料：小鼠的桑椹胚（2日齡），囊胚（3日齡）和延遲囊胚（4-6日齡）；豬的囊胚（7-10日齡）；綿羊的囊胚（7-9日齡）；山羊的囊胚（7-8日齡）；牛的桑椹胚（6-7日齡），囊胚（7-8）日齡；兔的囊胚（4-5日齡）；水貂的囊胚（8-10日齡）；倉鼠的囊胚（3日齡）。3.2.3早期胚胎及PGCS的培養(yǎng)和ES細胞的分離傳代

將早期胚胎或PGCs置於飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上，在5%CO2、37~39℃條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液一般為DMEM+15%胎牛血清（FCS）。培養(yǎng)液中可添加多種細胞因數(shù)或分化抑制物，如分化抑制因數(shù)（LIF）、表皮生長因數(shù)（EGF）、胰島素樣生長因數(shù)（IGF）、β—硫基乙醇（mercaptoethanol）等。

進行體外培養(yǎng)時，當胚胎內(nèi)細胞團ICM增殖後或PGCS出現(xiàn)ES樣克隆後即可傳代。ES細胞的增殖速度很快，小鼠ES細胞每7-8小時倍增一次，豬類ES細胞每20小時倍增一次，羊類ES細胞，每40-50小時倍增一次，牛類ES細胞每18-24小時倍增一次14。傳代時一般是用胰酶EDTA消化，在用微吸管或撥針將其打散成單個細胞，然後移入新的飼養(yǎng)層上，進行培養(yǎng)幾天後，即可出現(xiàn)新的克隆點，在其分化之前可以再進行傳代。3.2.4ES細胞的鑒定及保存

ES細胞的鑒定方法主要有形態(tài)學鑒定，鹼性磷酸酶（AKP）染色，表面抗原檢測，核型分析，體外分化實驗，嵌合體實驗，核移植等。

ES細胞保存方法一般是冷凍保存，比早期胚胎的凍存技術(shù)要簡單一些。冷凍保護液一般為DAEM+30%-50%NBCS（新建牛血清）+10%DMSO（二甲基亞碸）。冷凍過程為：室溫下平衡10分鐘→10℃冰箱3-5小時→-7℃冰箱過夜→第二天放入液氮中長期保存，也可以-70℃冰箱保存幾個月。解凍一般在37℃水浴中進行，解凍後立即用新的培養(yǎng)液替換冷凍保護液，隨後轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。4.ES細胞的應(yīng)用及前景ES細胞特有的生物學特性,決定了其在生物學領(lǐng)域有著不可估量的應(yīng)用價值.在進行ES細胞建系和定向分化的同時,在核移植,嵌合體,轉(zhuǎn)基因動物研究等方面也進行了廣泛的嘗試,已經(jīng)充分體現(xiàn)出ES細胞在加快良種家畜繁育,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物,哺乳動物發(fā)育模型,基因和細胞治療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景.

4.1ES細胞與動物克隆

ES細胞具有可以無限地傳代增殖，而且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點。如果以ES細胞作為核供體進行核移植,可以在短時間內(nèi)獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個體。而且用ES細胞與胚胎進行嵌合克隆動物,可以解決哺乳動物遠緣雜交的困難,生產(chǎn)出珍貴的動物,也可以進行異種動物克隆,有助於保護珍惜野生動物.自綿羊“多莉”出世後，許多科學家對體細胞克隆進行了大量的試驗，並取得了成功。但是，儘管體細胞克隆與ES細胞克隆相比有著易於取材的特點，但是體細胞克隆也存在著不少缺點，如生理和免疫缺陷，目前體細胞克隆還不能完全代替ES細胞克隆。4.2基因載體

目前常用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法是向受精卵中注射DNA，外源基因的整合、表達和篩選工作是在個體水準上進行的，不僅工作繁瑣，週期長成功率低，產(chǎn)生的後代的遺傳性狀也常出現(xiàn)分離；而利用ES細胞作為基因載體，得到基因整合的細胞，將載體ES細胞直接進行核移植或者通過與胚胎嵌合獲得嵌合動物，ES細胞在嵌合體中分化發(fā)育成全能性的生殖細胞，即可以得到攜有目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。因為一個優(yōu)良的ES細胞系不僅可以用於各種目的基因轉(zhuǎn)化，用各種方法將外源DNA導(dǎo)入細胞，而且外源基因的整合數(shù)目、位點、表達程式以及穩(wěn)定性等都可以在細胞水準上進行加工，篩選，在很大程度上加快了動物遺傳工程的進程?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少有關(guān)以ES細胞作為外源基因載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的報導(dǎo)。Hooper用逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA隨機插入和同源重組法得到了次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）缺失的ES細胞系，並獲得了HPRT缺失的嵌合體小鼠，建立了豬TGF-B1cDNA的ES細胞。曾諱清將HGF基因?qū)胄∈驟S細胞，獲得了轉(zhuǎn)染HGF基因的ES細胞。

一、加強飼養(yǎng)管理

二、推廣人工授精與同期發(fā)情技術(shù)

（一）準確發(fā)情鑒定與同期發(fā)情處理

（二）適時配種

（三）優(yōu)質(zhì)良種精液

（四）改善人工授精配種技術(shù)，嚴把無菌關(guān)

（五）提高情期受胎率

三、加強對圍產(chǎn)期疾病的防治

四、雙胎技術(shù)

五、不孕癥的治療

（一）卵巢機能減退

（二）持久黃體

（三）卵巢囊腫

（四）排卵障礙

一、概述

轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是把某一特殊基因從動物細胞中分離出來，或人為構(gòu)建外源目的基因，然後再將其轉(zhuǎn)移至另一動物的生殖細胞或早期胚胎，使其穩(wěn)定地整合到動物基因組中，並使該動物獲得前者的遺傳性而且能遺傳給後代，從而改變動物品種，獲取人類所需的特殊物質(zhì)。利用該項技術(shù)獲得的動物就是轉(zhuǎn)基因動物。

1968，雞；

1974，鼠；

1982，超級小鼠；

1994，超級豬；

現(xiàn)已獲得了多種基因、多畜種、