聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范

1本規(guī)范適用于模塊加熱的聚合酶鏈反應(PCR)分析儀計量性能的校準，對于其他GB/T6682—2008分析實驗室用水國家標準凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。一種對特定的DNA或RNA片段在體外進行快速擴增的方法，由變性—退火—延基于PCR(聚合酶鏈反應)技術原理，模擬DNA或RNA的復制過程，在模板、聚合酶鏈反應分析儀是基于PCR技術原理，模擬DNA或RNA的復制過程，在模板、引物、聚合酶等存在的條件下，特異擴增已知序列，對其進行檢測分析的儀器設備，包括定性PCR儀和定量PCR儀兩類。定性PCR通常由樣品載臺、熱循環(huán)部件、控制部件和電源部件等部分組成。定量PCR儀主要由樣品載臺、熱循環(huán)部件、控制部5計量特性計量特性見表1。定型PCR儀定量PCR儀溫度示值誤差十十溫度均勻度十十十十2表1(續(xù))定型PCR儀定量PCR儀十十十十6校準條件儀器使用允許的環(huán)境條件，測量過程中應測量和記錄環(huán)境的溫度、相對濕度。6.1校準設備及標準物質(zhì)6.1.1溫度校準裝置由若手個(通常為15個)精密溫度傳感器、數(shù)據(jù)采集分析模塊組成，測溫范圍(0～120)C,溫度校準裝置測量不確定度<0.1℃,且需要通過計量檢定。校準時應采用國內(nèi)外有證標準物質(zhì)，包括質(zhì)粒DNA標準物質(zhì)、核糖核酸標準物質(zhì)，其特性量值(拷貝數(shù)≥10°cops/,相對擴展不確定度≤5%)。規(guī)格：2μl10pL、100pL、200μL、1000μL,且需要通過計量檢定。校準前接照附錄A配制校準時使用的溶液。7校準項目和校準方法7.1校準條件校準前需將PCR儀開機預熱30mina7.2溫度示值誤差、溫度均勻性校準7.2.1將PCR儀及溫度校準裝置各部件連接完好，在溫度傳感器表面上涂抹適量的導熱油，按圖1所示將溫度傳感器置于PCR儀(96孔)加熱模塊設定孔中，其他型號的PCR儀可參照圖1進行測試。37.2.2參照送校單位提供的PCR儀說明書設定溫度控制程序，如表2所示，不能設定30℃為溫控程序起點的PCR儀，溫控程序參照表2進行設定。步驟設定溫度點設定溫度持續(xù)時間123456787.2.4溫度示值誤差校準結(jié)果按公式(1)和公式(2)計算：7.2.5溫度均勻度校準結(jié)果按公式(3)計算：47.3.1參照送校單位提供的PCR儀說明書設定該PCR儀的溫度控制程序，如表3所步驟設定溫度點設定溫度持續(xù)時間1237.3.2記錄儀器顯示溫度達到設定溫度恒溫10s后，取90℃溫度點，溫度記為TB,從TA到達TB的時間記為t,按圖2所示模式取點計按公式(4)計算平均升溫速率：7.3.3平均降溫速率校準結(jié)果按公式(5)計算：5取90℃溫度點，溫度記為TA,取50℃溫度點，溫度記為Tg,從TA到達T。的時間記為t,按圖2所示模式取點計算平均降溫速率。按公式(5)計算平均降溫速率：7.4定量PCR儀樣本示值誤差、樣本線性的校準7.4.1標準物質(zhì)的配制標準物質(zhì)配制方法見附錄A。7.4.2校準板的制備用經(jīng)過計量校準的移液器，將配制好的PCR反應體系加入到反應板中，按圖3所示準備96孔校準板，其他型號的儀器可參照本示例準備。PCR反應體系的配制方法見8a額駕NN4N鏈ACN2N1M7.4.3參照送校單位提供的PCR儀說明書設定該PCR儀的溫度控制程序，如表4所示。6步驟設定溫度點設定溫度持續(xù)時間121347.4.4分析參數(shù)的設置參照送校單位提供的PCR儀說明書設定PCR儀的數(shù)據(jù)分析參數(shù)。7.4.5樣本示值誤差按公式(6)計算樣本示值誤差7.4.6樣本線性以系列稀釋的標準物質(zhì)(至少5個)擴增Ct值與濃度對數(shù)值進行線性回歸，計算其線性回歸系數(shù)r。經(jīng)校準后的聚合酶鏈反應分析儀應填發(fā)校準證書，校準證書應符合JJF1071—2010中5.12的要求，參照附錄F給出校準項目名稱、測量值以及擴展不確定度。9復校時間間隔根據(jù)實際使用情況，用戶可自行確定儀器復校時間間隔，建議不超過1年。7標準物質(zhì)的準備及配制質(zhì)粒DNA標準物質(zhì)或核糖核酸標準物質(zhì)其特性量值(拷貝數(shù)≥10°copies/μL,相對擴展不確定度≤5%)滿足校準需求，水為符合GB/T6682—2008規(guī)定的一級水。電子天平，精度≤0.01mg;移液器，規(guī)格：100μL、1000μL,且需要通過計量將標準物質(zhì)從-20℃冰箱中取出，置冰上溶解，然后室溫平衡30min。用經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的純水進行稀釋配制，并定為陰性對照樣本。用電子天平配制系列稀釋樣品，其中S?為濃度為1×10°copies/μL的標準物質(zhì)，S?、S?、S?、S?、S?、S?、S?為S?系列稀釋后的樣品，每步樣品配制后要充分震蕩混勻，詳細配制方法見表A.1。終濃度以配制好的S。為起點，用經(jīng)過校準的天平(0.01mg)配制未知樣品1(U?)和未知樣品2(U?),樣品配制后要充分震蕩混勻，詳細配制方法見表A.2。8沿終濃度(copies/μL)9試劑終濃度體積1如果Mg2+、dNTPs和Taqenzyme已經(jīng)在10×PCRbuffer中，不需再加，如果使用2×PCRbuffer,調(diào)整加樣體積使終濃度合適，2ddH?O為滅菌雙蒸水，Probe為熒光標記探針，Primer為引物，Taqenzyme為熱啟動酶，buffer為緩沖溶液，dNTPs為四種脫氧核糖核苷-磷酸混合物溫度示值誤差校準結(jié)果的不確定度評定模型C.1測量模型△T溫控裝置工作區(qū)域內(nèi)溫度示值誤差，℃;T?！獪乜匮b置工作區(qū)域內(nèi)設定溫度值，℃;C.2不確定度來源(1)測量重復性引入的不確定度。(2)標準溫度傳感器引入的不確定度。C.3不確定度分量的計算(1)重復性引入的不確定度u?(T)在各個溫度測量時間段內(nèi)，讀取15個測溫探頭的數(shù)據(jù)，見表C.1,計算其標準偏表C.1重復性引入不確定度數(shù)據(jù)℃3030.5730.5330.5030.6930.0830.5630.6530.0530.6830.6930.1530.6930.75049.9849.9949.9050.0649.7850.0250.2049.8950.2050.3750.0350.3050.46059.5859.7059.5359.6759.6959.6459.8859.9059.8960.1460.0860.0060.1360.1859.970.37069.1669.4669.2169.3069.6969.3869.6269.9369.6369.9570.1769.7569.9088.6989.2388.8788.9189.8389.0489.3490.1789.3889.7890.4289.3989.6390.9593.4994.1793.8093.8394.9594.0494.3095.2894.3194.8195.5794.29`94.5795根據(jù)測量結(jié)果計算，(2)標準溫度傳感器引入的不確定度標準溫度傳感器校準不確定度由標準溫度傳感器校準證書得到。u?(T)=ue/k=0.090/2=0.045℃C.4標準不確定度一覽表標準不確定度一覽表見表C.2,表C.2標準不確定度一覽表合成不確定度用公式u(△)=√u?2(T)+u?2(T,)計算得到，結(jié)果見表C.3。合成不確定度擴展不確定度k222222附錄D樣本示值誤差結(jié)果的不確定度評定模型(1)重復性引入的不確定度u?(C?)計算未知樣1和未知樣2的定量結(jié)果的相對標準偏差RSD,12345678u?(C)=ue/k=4.3%/2=2.2%,D.5合成相對標準不確定度合成相對標準不確定度用公式u(△C)=√u?2(C?+u?2(C?)計算得到，結(jié)果見D.6擴展標準不確定度擴展不確定度用公式U=2u(△)×C,計算得到，結(jié)果見表D.3。C合成不確定度Uk22附錄E校準原始記錄參考格式