DNA的重組與轉(zhuǎn)座

第六章

DNA重組1基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必需維持一個恰到益處的平衡，這樣才干使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差別主要由兩種機(jī)制產(chǎn)生，一種是突變，一種是遺傳重組。2突變和重組是提供進(jìn)化起始物質(zhì)的兩個過程。突變引起的遺傳改動能引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列的變化，該變化引起表型的改動，經(jīng)過自然選擇發(fā)生作用。重組提供一個基因組構(gòu)造的變化，也會引起表型的變化，也經(jīng)過自然選擇發(fā)揚(yáng)作用。3DNA重組〔recombination〕是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移景象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合過程。4遺傳重組的存在確保了遺傳物質(zhì)代與代之間基因組的重排，從而構(gòu)成一個物種內(nèi)部個體之間的遺傳差別。遺傳重組不僅僅發(fā)生于代與代之間，一個個體的基因組也可以發(fā)生重排。重組不只是在減數(shù)分裂和體細(xì)胞核基因中發(fā)生，也在線粒體基因間和葉綠體基因間發(fā)生。5DNA重組的意義是能迅速添加群體的遺傳多樣性，經(jīng)過優(yōu)化組合積累有利突變，推進(jìn)生物進(jìn)化。此外，DNA重組還參與DNA損傷修復(fù)，某些基因表達(dá)的調(diào)控等重要的生物學(xué)過程。6根據(jù)不同的機(jī)制，可將重組分成4類：同源性重組〔homologousrecombination〕位點特異性重組〔site-specificrecombination〕異常重組〔illegitimaterecombination)轉(zhuǎn)座重組〔transpositionrecombination〕7許多重組反響利用不止一種機(jī)制進(jìn)展，例如免疫球蛋白VDJ銜接涉及到位點特異性識別和類似異常重組的過程；酵母接合型的轉(zhuǎn)換既有同源性重組和位點特異性重組的特征，也具有復(fù)制轉(zhuǎn)座過程的特征。經(jīng)過同源性重組將DNA序列引入真核基因組曾經(jīng)為研討高等生物開辟了一條新途徑。8用人工操作構(gòu)建DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，稱為DNA克隆或分子克隆〔molecularcloning〕。9第一節(jié)同源重組同源重組〔homologousrecombination〕發(fā)生在兩個同源DNA片段之間，是在兩個DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)展交換的一種重組方式。同源重組主要是利用DNA序列的同源性識別重組對象，由堿基序列提供識別的特異性。同源性重組最主要特征是相關(guān)的酶可以利用任何一對同源序列為底物。10真核生物減數(shù)分裂時的染色體之間的交換，某些低等真核生物及細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合，噬菌體的整合等都屬于同源性重組這一類型。在整個基因組中，同源重組的頻率并不恒定，并且跟染色體的構(gòu)造有關(guān)。例如在異染色體附近遺傳物質(zhì)的交換要遭到抑制。111.進(jìn)展同源重組的根本條件〔1〕在交換區(qū)具有一樣或類似的序列發(fā)生同源性重組的兩個區(qū)域的核苷酸序列必需是一樣或非常類似的。同源性重組經(jīng)常只發(fā)生在兩個DNA分子中的一樣部位。12〔2〕雙鏈DNA分子之間互補(bǔ)堿基進(jìn)展配對兩個DNA分子的鏈之間互補(bǔ)的堿基配對確珍重組只發(fā)生在同樣的基因座之間。在該部位兩個雙鏈DNA分子經(jīng)過鏈之間互補(bǔ)的堿基配對被維系在一同稱為聯(lián)會。13〔3〕重組酶參與重組反響的酶，保證重組的順利進(jìn)展。重組過程中，每個分子的鏈?zhǔn)紫葦嗔眩缓筮M(jìn)展修復(fù)和銜接，兩個DNA分子之間發(fā)生交換。重組完成后，重組分子的解離和釋放等過程均是在酶催化下進(jìn)展的。14〔4〕異源雙鏈區(qū)的構(gòu)成同源性重組時，在兩個DNA分子之間互補(bǔ)堿基配對的區(qū)域稱為異源雙鏈區(qū)〔heteroduplexregion〕。兩個DNA分子經(jīng)過一段異源DNA雙螺旋共價相互銜接。15162.同源性重組的分子模型第一個被廣泛接受的重組模型是1964年由RobinHolliday提出的Holliday模型。即將發(fā)生重組的兩個DNA分子同一個部位的兩個單鏈的斷裂，從而引發(fā)重組。兩個斷裂單鏈的游離端彼此交換，構(gòu)成兩個異源雙鏈，然后末端銜接構(gòu)成Holliday銜接體〔HollidayJunction〕?！?〕Holliday模型172018一旦Holliday銜接體構(gòu)成后，它能進(jìn)展重排從而改動鏈的彼此關(guān)系。這種重排稱為異構(gòu)化，由于在此過程中沒有鍵的割裂。一旦構(gòu)成Holliday銜接體后，就能被拆分。能否發(fā)生重組依賴于拆分時Holliday銜接體的構(gòu)象。192220232124222523Holliday模型被稱為雙鏈侵入模型，由于由于每一個DNA分子的一條鏈侵入到另一個DNA分子，它解釋了在重組時兩個DNA分子的異源雙鏈?zhǔn)侨绾螛?gòu)成的。Holliday銜接體也能經(jīng)過堿基之間氫鍵的斷裂和再銜接而發(fā)生左右挪動。這個過程稱為支鏈遷移〔branchmigration)。242725Holliday以為在DNA分子上存在某些位點，特殊的引發(fā)重組的酶可以識別這些位點，確保兩條鏈在一樣的部位被切斷。目前還沒有足夠的證據(jù)證明這些位點的存在。26〔2〕單鏈侵入模型單鏈侵入模型是對Holliday模型的修正。在該模型中，兩個DNA分子中的一個單鏈在隨機(jī)部位被切斷，然后暴露的末端侵入到另一個雙鏈DNA分子，發(fā)現(xiàn)它的互補(bǔ)序列以后將替代與它一樣的鏈。然后DNA聚合酶將用留下的那條鏈作為模板，填充上侵入鏈所留下的缺口。被替代的鏈被降解，它的殘留末端與另一分子中新合成的DNA鏈相銜接構(gòu)成Holliday銜接體。273028Holliday銜接體構(gòu)成以后，就會產(chǎn)生異構(gòu)化然后拆分。單鏈侵入模型中，異源雙鏈?zhǔn)紫戎辉趦蓚€DNA分子中的一個構(gòu)成。Holliday中間體構(gòu)成以后經(jīng)過支鏈遷移可以在另一個DNA分子上產(chǎn)生異源雙鏈，這樣就解釋了異源雙鏈?zhǔn)侨绾螛?gòu)成的。29⑦⑤30〔3〕雙鏈斷裂修復(fù)模型目前證明經(jīng)過兩個DNA分子之中的一個雙鏈斷裂引發(fā)重組是個常見的機(jī)制。該模型以為參與重組的兩個DNA分子之一的兩條鏈被核酸內(nèi)切酶切斷，然后在核酸外切酶作用下產(chǎn)生3’單鏈黏性末端。兩個3’游離末端之一侵入到另一個雙螺旋的同源區(qū)，置換“供體〞雙螺旋的一個單鏈而構(gòu)成一段異源雙鏈DNA，并同時產(chǎn)生一個D環(huán)〔D-loop〕。3134323533D環(huán)在DNA聚合酶的作用下修補(bǔ)而擴(kuò)展，直至D環(huán)的長度與“受體〞DNA雙螺旋缺口長度相當(dāng)，互補(bǔ)的兩條單鏈退火。此時在缺口的兩側(cè)各有一段異源雙鏈DNA，兩個雜合雙螺旋之間為斷裂的缺口，并且此缺口為供體DNA序列所填充。缺口處雙鏈的完好性可以被以缺口3’端為起始的修補(bǔ)合成來修復(fù)。缺口是被兩次單鏈DNA的合成而修復(fù)的。3437353836大腸桿菌重組的分子根底在分子程度上，重組事件發(fā)生的先后順序是類似的：從一個已斷裂的分子中產(chǎn)生的單鏈與其對應(yīng)的雙螺旋發(fā)生作用，配對區(qū)間擴(kuò)展，重組中間體構(gòu)成直到核酸內(nèi)切酶解離此兩個雙螺旋分子。識別反響是重組機(jī)制的不可分割的重要部分，并且只涉及到DNA分子的特定區(qū)域而不是整個完好的染色體。371.chi位點和RecBCD核酸酶在λ噬菌體的一些突變種內(nèi)，存在一些稱為chi的位點。chi位點單一的堿基對的改動即可激發(fā)重組的發(fā)生。這些位點皆含有一個恒定的非對稱的8bp序列：5’GCTGGTGC3’3’CGACCACC5’38Chi位點是一個由基因recBCD編碼的RecBCD酶作用的靶部位。RecBCD酶是一種多功能酶，具有幾種不同的活性。它是一個強(qiáng)有力的降解DNA的核酸酶，早期被檢定為活性核酸外切酶V，具有解旋酶的活性。RecBCD所介導(dǎo)的解旋和切割可以被用來產(chǎn)生末端，并引發(fā)異源雙鏈的構(gòu)成。394240434144422.RecA和Holliday銜接體的構(gòu)成RecA具有兩種相當(dāng)不同的活性:RecA可以促進(jìn)單鏈DNA與其在雙鏈DNA分子中互補(bǔ)的DNA鏈的堿基相配對。RecA還可以在SOS反響中激活蛋白酶。RecA需求單鏈DNA和ATP才干激活蛋白酶。43RecA可以利用由RecBCD在Chi位點附近切割所釋放的單鏈3’末端。RecA的DNA操作酶活性可以使一個單鏈DNA與雙螺.旋中的同源序列發(fā)生置換，這一反響被稱為單鏈攝取(single-stranduptake)或單鏈同化(single-strandassimilation)。444546473.Ruv蛋白和Holliday銜接體的拆分大腸桿菌有一組由三個基因編碼與隨后的重組相關(guān)聯(lián)的蛋白。ruvA和ruvB基因的產(chǎn)物促進(jìn)異源雙鏈的構(gòu)成。RuvA蛋白可以識別Holliday銜接體的構(gòu)造，RuvB是一個腺苷三磷酸酶并能夠提供支鏈遷移的動力。48RuvA在交叉點處與DNA一切的4條鏈相結(jié)合，在交叉點的上游，兩個RuvB六聚體環(huán)狀構(gòu)造分別與每個雙螺旋相結(jié)合。RuvAB蛋白復(fù)合體可以使支鏈以10～20bp的速度遷移。49第三個基因ruvC編碼一種可以特異性地識別Holliday銜接體的核酸內(nèi)切酶，此酶可以在體外切斷此種交叉而拆分重組中間體。一個含4個堿基的序列提供了RuvC拆分Holliday銜接體的熱點。這一序列決議了拆分過程中哪一對DNA鏈被切斷，從而決議發(fā)生的是補(bǔ)丁型重組〔patchrecombination〕還是剪接型重組〔splicerecombination〕。50535154525553第二節(jié)位點特異性重組位點特異性重組是指發(fā)生在DNA特異性位點上的重組。與同源重組不同，位點專注性重組不是由DNA序列的同源性所引導(dǎo)，而是在結(jié)合序列部位由專注的酶來催化斷裂重接。位點專注性重組是由使相應(yīng)酶出現(xiàn)的調(diào)理過程所引發(fā)，而同源重組那么是由能與RecA蛋白結(jié)合的DNA序列隨機(jī)斷裂引發(fā)的。

54位點特異性重組最早是在λ噬菌體的遺傳學(xué)研討中發(fā)現(xiàn)的。λ噬菌體DNA經(jīng)過重組整合到大腸桿菌染色體的專注性位點上，轉(zhuǎn)變成為原噬菌體DNA的非活性形狀。λ噬菌體有兩種存在型式：裂解形狀和溶源形狀。兩種類型間的轉(zhuǎn)換是經(jīng)過位點特異性重組實現(xiàn)的。55根據(jù)重組所涉及的體系和重組位點的方向，位點專注性重組可以介導(dǎo)3類反響：分子間位點專注性重組產(chǎn)生整合或交融；重組位點的正向順序間的分子內(nèi)位點專注性重組產(chǎn)生剪切和解離；重組位點的反向順序間的分子間位點專注性重組產(chǎn)生倒位。56位點特異性重組的功能：調(diào)理噬菌體DNA與宿主菌染色體DNA的整合；調(diào)理特定基因的表達(dá)；調(diào)理胚胎發(fā)育期間程序性的DNA重排。57λ噬菌體DNA的整合與切除為了進(jìn)入溶源形狀，游離的DNA必需整合〔intergrate〕到細(xì)菌DNA中去；而為了從溶原形狀向裂解形狀轉(zhuǎn)化，原噬菌體DNA那么必需從細(xì)菌染色體DNA上切除〔excise〕。整合和切除均經(jīng)過細(xì)菌DNA和λDNA上特定位點—附著點〔attachmentsite，att〕之間的重組而實現(xiàn)。58細(xì)菌染色體上的附著點〔attλ〕稱為attB，含有B、O、和B’三個序列〔BOB’〕。突變后可以阻止λDNA的整合。λ噬菌體的附著位點稱attP，由P、O和P’三個序列組成。其中O序列是attB和attP所共有的，序列完全一致，稱中心序列〔coresequence〕，是位點特異性重組發(fā)生的地方。596260整合反響由λ噬菌體int基因的產(chǎn)物整合酶〔integrase,Int〕催化。Int是一種DNA結(jié)合蛋白，對POP’序列有強(qiáng)的親和力。整合反響還需求一種有大腸桿菌編碼的一種細(xì)菌蛋白，稱為整合宿主因子IHF(integrationhostfactor,IHF)。Int和IHF可以在體外進(jìn)展位點特異性重組。616462切除反響發(fā)生在原噬菌體兩端的attL和attR之間，產(chǎn)物為λ噬菌體環(huán)狀DNA和細(xì)菌染色體DNA。催化切除反響的除了Int和IHF外，還需求一種叫做切除酶〔exicisionase,Xis〕的蛋白參與，該酶由λ噬菌體的cis基因編碼。Xis對控制反響方向起重要作用，它是切除反響所需求的，但卻抑制整合反響。63整合和切除反響所需求識別的序列對不一樣。整合要求對attB和attP之間進(jìn)展識別，但切除要求對attL和attR識別。因此位點特異性重組的方向性特征由重組位點的特征所控制。整合和切除反響皆需Int和IHF蛋白。64λ噬菌體DNA的整合機(jī)制λDNA的整合涉及到attB和attP的中心序列DNA鏈的割裂和重接。首先在attB和attP位點上產(chǎn)生同樣的交錯切口，構(gòu)成了5’-OH和3’-P的末端。5’單鏈區(qū)全長7個堿基。兩個中心區(qū)的斷裂完全一樣，銜接過程不需求任何新DNA的合成。在整合反響中，互補(bǔ)的單鏈末端交互雜和，銜接并完成整合過程。6568666967整個反響中沒有可以自在旋轉(zhuǎn)的中間體。斷裂和重新結(jié)合反響與拓?fù)洚悩?gòu)酶I催化的反響機(jī)制相類似，不同的是相互銜接的兩條鏈不是來自于同一雙螺旋，而是來自于不同的雙螺旋。68第三節(jié)異常重組異常重組〔illegitimaterecombination〕是指發(fā)生在彼此同源性很小或沒有同源性的DNA序列之間的重組。異常重組可發(fā)生在DNA很多不同的位點之上。異常重組能夠是最原始的重組類型，不需求對特異性序列進(jìn)展識別的復(fù)雜系統(tǒng)或?qū)NA同源序列進(jìn)展識別的機(jī)制。69異常重組按其機(jī)制主要分為兩類：末端銜接〔end-joining〕和鏈滑動〔strand-slippage〕。末端銜接是指斷裂的DNA末端彼此相連。鏈滑動是指DNA復(fù)制時，由一個模板騰躍到另一個模板所引起的重組。70許多DNA序列都可發(fā)生上述兩類的異常重組，這直接要挾著基因組的完好性，但同時也是進(jìn)化的重要途徑。異常重組可以產(chǎn)生許多不同的結(jié)果，例如移碼、缺失、倒位、交融和DNA擴(kuò)增。711.末端銜接末端銜接在40年代初次被BarbaraMcClintock發(fā)現(xiàn)。斷裂末端可以經(jīng)過斷端直接對接相連。然而，假設(shè)斷端不能直接相連〔如兩末端的極性一樣時〕，它們可以經(jīng)過堿基配對，然后末端合成修復(fù)。斷裂銜接后產(chǎn)生新的銜接體。該過程和末端DNA的序列無關(guān)，也不要求兩端之間有任何同源性。722.鏈滑動1966年，GeorgeStreisinger提出，經(jīng)過新合成的DNA鏈與其模板的錯配可導(dǎo)致移碼突變。同樣機(jī)制在較大的范圍內(nèi)發(fā)生時，可以產(chǎn)生DNA的缺失和擴(kuò)增。某些正向反復(fù)序列似乎是鏈滑動發(fā)生的熱點。73第四節(jié)轉(zhuǎn)座重組基因組是相對穩(wěn)定的，基因組中的序列通常處于恒定的位置。因此，我們可以經(jīng)過構(gòu)建遺傳圖譜(geneticmap)來鑒定知基因的基因座。在分子程度上，每個個體基因組之間的差別主要由重組引起，但轉(zhuǎn)座元件〔transposableelement〕或轉(zhuǎn)座子〔transposons〕的存在也可以呵斥基因組的改動。7475轉(zhuǎn)座子的概念及發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子(transposon或transposableelement)是基因組內(nèi)相對獨立的、可挪動序列，它們不用借用噬菌體或質(zhì)粒的方式就可以從基因組的一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位，這個過程稱為轉(zhuǎn)座〔transposition〕。轉(zhuǎn)座子每次挪動時攜帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一同在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱騰躍基因〔jumpinggene〕。76轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分，不以獨立的方式存在〔如噬菌體或質(zhì)粒DNA〕。轉(zhuǎn)座的發(fā)生不依賴于轉(zhuǎn)座子和靶位點之間任何的序列同源性，在基因組內(nèi)由一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位。轉(zhuǎn)座以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機(jī)的.77轉(zhuǎn)座子有時插入到一個構(gòu)造基因或基因調(diào)理序列內(nèi)，引起基因表達(dá)的改動。轉(zhuǎn)座子也可以引起基因組序列的重排，它們的挪動也和進(jìn)化有關(guān)。78轉(zhuǎn)座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遺傳學(xué)研討中發(fā)現(xiàn)的，她稱之為控制元件〔controllingelement〕，由于它不僅可以在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且還可以改動基因的活性并引起功能的改動。如今以為轉(zhuǎn)座子存在于地球上一切的生物。7980轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座子分為兩個根本類型：一種是以編碼蛋白質(zhì)的DNA序列的方式存在，其編碼的蛋白能直接操作DNA，從而使轉(zhuǎn)座子可以在基因組內(nèi)繁衍其本身。另一種與反轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)，并且它們可挪動的特性來自于它們能由RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生DNA拷貝，這種DNA拷貝然后被整合到基因組的新位點。81轉(zhuǎn)座子的作用轉(zhuǎn)座元件可直接或間接地促進(jìn)基因組的重排。轉(zhuǎn)座子的間歇的活動性似乎為自然選擇提供了一個不確定的靶部位。82轉(zhuǎn)座子是位于基因組內(nèi)的一個獨立的實體。轉(zhuǎn)座子與基因組的這種關(guān)系相當(dāng)于寄生蟲與宿主的關(guān)系。轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增能夠經(jīng)過產(chǎn)生有害的結(jié)果而得到平衡。在原核和真核細(xì)胞內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過DNA挪動的轉(zhuǎn)座子的存在。83原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1.插入序列(insertionalsequence,IS)2.復(fù)合轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)3.TnA家族841.插入序列最簡單的轉(zhuǎn)座子被稱為插入序列IS〔insertionsequences,IS〕。IS元件是細(xì)菌染色體和質(zhì)粒的正常組成部分。最早被鑒定的轉(zhuǎn)座元件是細(xì)菌支配子中的自主插入序列。這種插入阻止了插入部位基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。85IS元件是獨立的構(gòu)造單位，每個元件只編碼為本身轉(zhuǎn)座所需求的蛋白質(zhì)。IS元件的末端為短的反向末端反復(fù)序列〔invertedterminalrepeats〕，通常這兩個拷貝親密相關(guān)，但并不完全一樣。86在插入部位，ISDNA總是和很短的正向反復(fù)序列〔directrepeats〕相連。但在插入之前靶部位只需這兩個反復(fù)序列中的一個。轉(zhuǎn)座后在轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)各存在一個此序列的拷貝。轉(zhuǎn)座的結(jié)果是靶部位序列構(gòu)成了兩個正向反復(fù)序列。879088ITRTSD89IS元件具有一個典型的構(gòu)造，它的末端為反向反復(fù)序列，而與其相連的宿主DNA的末端為短的正向反復(fù)序列。當(dāng)在一段DNA序列中見到這種構(gòu)造類型時，可被用來鑒別轉(zhuǎn)座子。90反向反復(fù)序列標(biāo)明了轉(zhuǎn)座子的末端。一切類型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座皆需轉(zhuǎn)座酶〔transposase〕對末端的識別。阻止轉(zhuǎn)座的“順式作用〞〔cis-acting〕突變位于末端。91除IS1之外，一切的IS元件皆含有一個單一的長編碼區(qū)，其起始于一端的反向反復(fù)序列之內(nèi)，而剛好終止于另一端的反向反復(fù)序列之前或之內(nèi)，它編碼轉(zhuǎn)座酶。922.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子一些轉(zhuǎn)座子除了具有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的功能外，還攜帶藥物抗性〔或其他〕標(biāo)志，這些轉(zhuǎn)座子被命名為Tn。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子〔compositetransposons〕的中心區(qū)攜帶藥物抗性標(biāo)志，兩側(cè)為由IS元件組成的臂。9396949795由于臂由IS組成，每個IS具有通常的反向反復(fù)末端構(gòu)造，因此復(fù)合型轉(zhuǎn)座子具有同樣的短的反向反復(fù)末端。一個功能性的IS構(gòu)造單位能轉(zhuǎn)座它本身或整個轉(zhuǎn)座子。