高效液相色譜法檢驗(yàn)操作規(guī)程

高效液相色譜法檢驗(yàn)操作規(guī)程一、范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用高效液相色譜法的檢驗(yàn)方法和操作要求；適用于本公司檢品采用高效液相色譜法的質(zhì)量檢測(cè)。二、引用標(biāo)準(zhǔn)：中華人民共和國(guó)藥典（2000年版二部附錄）三、儀器的組成和一般要求：1、儀器的組成：高壓輸液泵；色譜柱；檢測(cè)器；積分儀；打印機(jī)。2、對(duì)儀器的一般要求：所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動(dòng)相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)健合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測(cè)器為紫外吸收檢測(cè)器。在用紫外吸收檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外分光光度法（藥典2000年版附錄IVA）項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求。正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長(zhǎng)度、固定相牌號(hào)、載體粒度、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。2.1紫外分光光度法項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求：用1cm石英吸收池盛溶劑，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)），測(cè)定其吸收度。溶劑和吸收池所吸收度，在220~240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241?250nm范圍內(nèi)不得超過0.20，在251?300nm范圍內(nèi)不得超過0.10，在300nm以上時(shí)不得超過0.05。四、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求，或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。1、色譜柱的理論板數(shù)（n）在先定的條件下，注入供試品溶液或品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR（以分鐘或長(zhǎng)度計(jì)，下同，但應(yīng)取相同單位）和半峰高寬（Wh/2）,按n=5.54（tR/Wh/2）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。

如果測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如信長(zhǎng)、載體性能、色譜柱允填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。2、分離度分量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計(jì)算公式為：2（tR2-tR1）R=——————W1+W2式中 tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間;W］及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。3、重復(fù)性取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。4、拖尾因子為保證測(cè)量精度，特別當(dāng)采用峰高法測(cè)量時(shí)，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子（T）是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因T— T— ————2d1式中W0.o5h為0.05峰高處的峰寬；

d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95?1.05之間。五、操作方法：定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法成峰高法。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，須采用峰面積法。1、外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品的供度品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測(cè)量對(duì)照品和供試品待測(cè)成分的峰面積（或峰高），按下式計(jì)算含量：Ax含量（CX）=CR? Ar式中符合意義：CX:為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度：mg/ml;AX：為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；CR:為對(duì)照品的濃度：mg/ml；Ar：為對(duì)照品的峰面積或峰高。2、 加校正因子的主成分身對(duì)照法：測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分身身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)成分對(duì)照品各適量，配制測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述5.1法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正固子可直接載入各品種正文中，用于校正雜質(zhì)的實(shí)則峰面積。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)儀器靈敏度（以噪音水平可接受可限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限），使對(duì)照溶液的主成分色譜峰高約達(dá)滿量程的10%~25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分（面積約為通常條件下滿量程峰積分值的10%）。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成成保留時(shí)間的若干倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。3、 不加校正因子的主成分身身對(duì)照法：當(dāng)沒有雜質(zhì)對(duì)照品時(shí)，可采用不加校正因子的主成分身身對(duì)照法同。上述5.2法配制對(duì)照溶液并調(diào)節(jié)儀器靈敏度后取，供試品溶液和對(duì)照溶液適量分，別進(jìn)樣，前者的記錄時(shí)間除另有規(guī)定外應(yīng)為主成分保留時(shí)間的若干倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶液峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖I,再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖II。色譜圖I上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖II上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計(jì)算。4、面積歸一化法：由于峰面積歸一化法測(cè)定誤差大,因此,本法通常只能用于粗略考察供試品中的