黃曲霉M1酶聯(lián)免疫法檢測方法

黃曲霉毒素Ml酶聯(lián)免疫測試概述TMREAGEN黃曲霉毒素Ml酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒可用于檢測乳酪，牛奶和奶粉中黃曲霉毒素Ml的殘留。黃曲霉毒素Ml是黃曲霉素素B1羥基化的產(chǎn)物。黃曲霉毒素已被確認(rèn)是最常見的致癌物。該試劑盒特點(diǎn)包括：樣品無需前處理提取，可直接用于檢測。應(yīng)用于牛奶檢測時(shí)有高靈敏度（0.005ng/g或ppb）低檢測限（0.005ng/g或ppb）。高重現(xiàn)性。試劑盒原理TMREAGEN黃曲霉毒素Ml酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒基于競爭性酶聯(lián)反應(yīng)原理，相關(guān)的抗體已經(jīng)包被于微孔板上。藥物分析時(shí)，樣品加入微孔孵育，洗板后加入酶標(biāo)記物，若樣品殘留有黃曲霉Ml就會競爭包被抗體，抑制HRP酶標(biāo)與包被抗體結(jié)合，加入TMB后顯色反應(yīng)，顏色顯色強(qiáng)度與樣品中靶毒素的含量成反比。3.試劑盒組成部分和儲存內(nèi)容物規(guī)格保存條件黃曲霉毒素Ml包被板（AflatoxinMlPlate）96孔板（12X8孔）2-8C黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品(Standards):0ng/ml陰性質(zhì)控(Negativecontrol)1.8mL0.005ng/mL1.8mL0.015ng/mL1.8mL0.03ng/mL1.8mL2-8C0.09ng/mL1.8mL0.27ng/mL1.8mL回收用10ng/ml（Spiking，可選）1.8mlHRP-酶標(biāo)記物(HRP-Conjugate)12mL2-8C20X濃縮洗液(WashSolution)28mL終止液(StopBuffer)14mLTMB底物(TMBSubstrate)12mL10xPBS緩沖液（可選）25mL10x牛奶提取液（可選）5mL本試劑盒應(yīng)當(dāng)在2-8C的溫度下儲存，有效期為一年。如果一個(gè)月內(nèi)不使用試劑盒，黃霉素毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品和HRP-酶標(biāo)應(yīng)置于-20°C或者冷凍保藏。4.樣品檢測下限檢測物質(zhì)檢測下限（ng/g）牛奶0.005奶粉0.005（按1:10稀釋成液體奶）乳酪0.05酸奶0.015.交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)藥物交叉反應(yīng)率（％）黃曲霉毒素M1(AflatoxinMl)100黃曲霉毒素B1(AflatoxinBl)46黃曲霉毒素B2(AflatoxinB2)35黃曲霉毒素M2(AflatoxinM2)29黃曲霉毒素G1(AflatoxinG1)27黃曲霉毒素G2(AflatoxinG2)6未提供的設(shè)備或材料1） 酶標(biāo)儀（450nm）2） 微量加樣器（lO、20、l00和lOOOpL各一支）3） 多道槍：50-300"4） 黃曲霉Ml清洗試劑（可選）注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前請閱讀以下文字，以保證獲得最佳實(shí)驗(yàn)效果。標(biāo)準(zhǔn)品中含有黃曲霉毒素Ml，請小心使用。不要使用過期的試劑盒。不同批次的試劑盒不要混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。確保酶標(biāo)物正確使用。盡量保持室溫(22.5±2.5)°C,避免在通風(fēng)口操作防止溫度過低，過熱和/或者蒸發(fā)。同樣的，不要在陽光直射下實(shí)驗(yàn)，防止過熱及蒸發(fā)。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應(yīng)該鋪墊若干紙巾或者其他物料。水質(zhì)量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。加入樣品或者試劑到空的微孔板時(shí)，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。孵育時(shí)間的計(jì)算越規(guī)范越好，保持添加標(biāo)準(zhǔn)品的一致性，先添加標(biāo)準(zhǔn)品后添加樣品。從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)品曲線質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)。將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。樣品的制備樣品保存在2-4°C不超過1-2天，如果需要保存較長的時(shí)間，應(yīng)該放置-20°C。樣品使用前應(yīng)恢復(fù)到室溫。lxPBS緩沖液制備取1體積lOxPBS緩沖液加9體積蒸餾水lx牛奶提取液制備取1體積10x牛奶提取液加9體積蒸餾水牛奶通常鮮奶和勻質(zhì)奶可直接用于檢測反應(yīng)，但是對于一些高背景值含脂牛奶，需經(jīng)8000rpm離心5min或4000rpm離心10min，棄去上層脂肪層，方可用于檢測。稀釋倍數(shù)：1.0奶粉取1g奶粉，加入蒸餾水定容到10ml,振蕩使其溶解(溶解后的奶粉相當(dāng)于普通液態(tài)牛奶)。對于有高背景值的含脂牛奶，需8000rpm離心5分鐘或者4000rpm離心10分鐘，棄去上層脂肪層，方可用于檢測稀釋倍數(shù)：1.0(此倍數(shù)計(jì)算出的結(jié)果為奶粉稀釋成液態(tài)奶后的結(jié)果)乳酪取1g乳酪加入2ml甲醇，渦旋振蕩15分鐘使其充分混勻；4000rpm離心5分鐘，移取1ml上清液到一離心管，加250mg黃曲霉M1清洗試劑；渦旋5分鐘，再4000rpm離心5分鐘，取0.2ml上清液加0.8mL1xPBS緩沖液混勻，每孔取200pL用于檢測稀釋倍數(shù):10酸奶取0.5ml酸奶樣品，加入0.5ml1x牛奶樣品提取液，最大轉(zhuǎn)速渦流3分鐘；4000rpm離心5分鐘；每孔取200ML用于檢測(避免取到上層脂肪層)稀釋倍數(shù)：29檢測步驟試劑準(zhǔn)備：注意：試劑在使用之前要在室溫下解凍1-2小時(shí)，確定在使用前閱讀過注意事項(xiàng)。準(zhǔn)備適量的檢測用試劑，所有的試劑搖勻后使用。準(zhǔn)備足夠所有小管所需的用量，不能將試劑倒回原來的瓶子中，處理試劑時(shí)建議用廢棄的瓶子以降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。1x洗液的制備1體積的20x洗液同19體積的蒸餾水混合。檢測：以下為計(jì)算份量的表格，用戶可根據(jù)自己的需要來確定需要配置多少試劑。試劑每個(gè)反應(yīng)需要的體積24次反應(yīng)的體積酶標(biāo)記物100pL2.4mL工作洗液1.0mL24mL終止液100pL2.4mL底物100pL2.4mL加入200M的標(biāo)準(zhǔn)于所設(shè)定的孔中(從低濃度至高濃度);加入200"的樣品于所設(shè)定的孔中；常溫(20^25°C)避光孵育60分鐘；洗板3次，每次加入250pLIX洗液，最后一次盡量甩干并在吸水紙上吸干；每孔加入100pL酶標(biāo)記物；室溫(22.5±2.5)°C避光孵育15分鐘；洗板3次，每次加入250pLIX洗液，最后一次盡量甩干并在吸水紙上吸干；加入100"的TMB底物，用手敲板邊緣1分鐘混合均勻；在室溫(22.5±2.5)°C避光培養(yǎng)15分鐘，加入100pL的終止液終止反應(yīng);在450nm下讀OD值(讀數(shù)前，用無絨布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。10?結(jié)果計(jì)算分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值。相對吸光度值(%)=(標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值